изоляты, и два контрольных штамма далее были проанализированы, используя ПЦР метод геномных «отпечатков пальцев» с одним праймером (ядро M13) и по альфаглюколидазной активности (альфаGlu). По результатам данных исследований ПЦР метод геномных «отпечатков пальцев» и оценка альфа-Glu деятельности являются надежными методами дифференциации P. multocida subsp. multocida от P. multocida subsp. septica, особенно в штаммах, которые слабо или несоответственно ферментируют сорбитол [210].
Капсула штаммов ATCC 11039 серотипа А Pasteurella multocida состоит из гиалуроновой кислоты и является важным фактором вирулентности. Повторное субкультивирование определенных штаммов капсульных серотипов приводит к диссоциации от капсульных до акапсульных фенотипов с сопутствующей потерей вирулентности. Хотя акапсульные варианты, как полагали, возникли в результате мутации, молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса, неизвестны. Watt JM, Swiatlo E, Wade MM, Champlin FR. продемонстрировали, что восстановление капсульного фенотипа происходит в естественных условиях в результате внутрибрюшинного заражения мышей BALB/c акапсульным вариантом. Кроме того, анализ ОТ-ПЦР показал капсульный локус, находящийся под транскрипционным контролем. Клонирование и секвенирование 290-п.о. фрагмента в пределах промотора, содержащего интергенный регион капсульного локуса 11039/iso, показали, что после субкультивирования не произошло никаких существенных изменений. Эти результаты демонстрируют, что штамм ATCC 11039 серотипа А P. multocida, регулирует капсульную экспрессию в ответ на неопознанный фактор среды, таким образом обеспечивая способность проникновения в суть молекулярных механизмов, лежащих в основе диссоциации колоний [211]. Shivachandra SB, Kumar AA, Chaudhuri P. использовали REPПЦР, ERIC - ПЦР, и ПЦР с одним праймером для молекулярной характеристики 66 птичьих штаммов Pasteurella multocida серогруппы A:1, изолированных от разных видов птиц, из различных областей Индии. REPПЦР привела к амплификации повторных последовательностей генома, в диапазоне примерно от 200 до 3000 п.о., которые составляли в общей сложности 54 различных профиля (D=0.99). Анализ ERIC-ПЦР также произвел амплифицированные продукты в диапазоне приблизительно от 200 до 3200 п.о., категоризирующие штаммы в общей сложности 50 различных профилей (D=0.98). Амплификация повторных областей, используя микросателлитные праймеры (GTG), привела к четко дифференцированным группам в пределах приблизительно от 200 до 2400 п.о. Штаммы были разделены на 43 профиля (D=0.96). Генотипные
профили птиц-хозяев не коррелировали с географической областью их происхождения. Птичьи штаммы P. multocida серогруппы A:1, были очень гетерогенными с разнообразными профилями. Метод REP-ПЦР, как показали исследования, очень специфичен и прост для дифференцирования фенотипически подобных штаммов. Данное исследование также показало, что ПЦР основанный на амплификации повторных областей P. multocida – быстрый метод с хорошей дискриминацией, который может использоваться непосредственно для рутинного типирования изолятов выделенных при вспышках пастереллезов домашней птицы [212].
Leotta GA, Chinen I, Vigo GB, Gugliada J, Rivas M. провели исследования для оценки двух методов молекулярного типирования - ERIC-ПЦР и Apal-PFGE, с целью изучения Pasteurella multocida. Были определены видовые особенности, воспроизводимость, и отличительные особенности, для установления генетического родства штаммов P. multocida. Были изучены сорок девять штаммов из различных источников, биотипов, капсульной группы, соматических серотипов, и резистентности к антибактериальным препаратам. В ERIC-PCR был определен 31 образец 10 - 14 групп в размере 0.2 и 1.2 КБ. В Apal-PFGE были установлены 37 рестриктированных образцов 7 - 15 групп в размере 34 - 450 КБ. Типоспецифичность составляла 100 % (T=1) для ERIC-PCR, и 94 % (T = 0.94) для Apal-PFGE. Воспроизводимость обоих методов составляла 100 %, разделение на профили составляло 93 % (D = 0.93) для ERIC-ПЦР, и 98 % (D = 0.98) для Apal-PFGE. При использовании обоих методов, эпизоотологически связанные штаммы были сгруппированы, несвязанные штаммы были четко дифференцированы [213].
Бельгийскими учеными был исследован 141 изолят Pasteurella multocida, и 34 изолята Mannheimia haemolytica sensu lato, выделенных из верхних дыхательных путей здоровых телят, для сравнения классического фенотипирования с тДНК – ПЦР генотипированием, и с другой стороны, попарным сравнением результатов дисковой диффузии в агаре для семи антибактериальных составов (ампициллин, цефтиофур, окситетрациклин, гентамицин, флорфеникол, энрофлоксацин и триметоприм. Фенотипирование и генотипирование хорошо коррелировали (> 90 %). Попарные сравнения методов чувствительности к антибиотикам были исследованы традиционно посредством расчета погрешности обязательных норм специфичности и чувствительности и особенностей методики. Специально определявшаяся чувствительность для старых антибактериальных агентов (окситетрациклин, гентамицин, триметоприм) часто оказывалась ниже 85 %. Почти для всех антибактериально-бактериальных комбинаций специфичность превысила 90%. Ученые пришли к заключению, что метод дисковой
диффузии надежен в эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга [214.]
Российские ученые Афонюшкин В.Н., Коптев В.Ю., Юшков Ю.Г., Шкиль Н.А. разработали мультиплексную ПЦР для детекции геномной ДНК P. aerugenosa и микроорганизмов рода Pasteurella и синегнойной палочки в патологическом материале сельскохозяйственной птицы. Мультиплексная ПЦР позволяет контролировать наличие определенного спектра микроорганизмов в одной реакции. По мнению ученых к негативным факторам, ограничивающим применение мультиплексных ПЦР в системе скрининга и мониторинга различных инфекций относят более высокий риск неспецифических реакций ввиду наличия в реакционной смеси нескольких пар праймеров и снижение чувствительности реакции в связи с конкуренцией за компоненты реакционной смеси при синтезе нескольких разных ампликонов [215].
Однако в ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение ввиду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом.
Пастереллез и псевдомоноз с./х птицы обычно сопровождается инфицированием одних и тех же органов и тканей (легкие, сердце, паренхиматозные органы) поэтому использование мультиплексной ПЦР будет вполне уместно для дифференциальной диагностики, в то же время биологические особенности пастерелл и псевдомонасов не создают существенных предпосылок для развития ассоциированных инфекций. В этой связи, риск конкурентного ингибирования одной из реакций – минимален.
1.3 Геном бактерии пастереллеза и кодируемые им белки P. multocida является мультипатогенным возбудителем, индуцирующим инфекционные патологии у многих видов млекопитающих и птиц.
Из многочисленных факторов вирулентности P. multocida наиболее значимыми являются полисахариды капсулы, эндотоксины или липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии и адгезины, экзотоксины, внеклеточные ферменты (липаза, гиалуронидаза) и др. [].
В 2001 году Barbara J. May [216] c сотрудниками из Национального центра токсикологии и безопасности питания университета штата Мичиган методом случайного секвенирования и компьютерного анализа провели исследования 53 000 фрагментов последовательностей штамма Pm 70, которые были, затем собраны в одинарную циркулярную последовательность 2 257 487 п.о.
