10 буферных растворов которые, были апробированы в ходе работы, различались концентрацией хлористого магния и калия, а также величиной рН.

Состав буферных систем приведен в таблице 13.

Таблица 13 – Состав буферных растворов, используемых при оптимизации ПЦР

Использовали реакционную смесь для амплификации ДНК объемом 50 мкл следующего состава:

х50 универсальный буфер (20 мМ ТрисHCl, pH 8.0, 250 нМ ЭДТА - 1 мкл х10 (один из 10 буферов) ПЦР буфер - 5 мкл 10 мМ dNTP mix - 1 мкл Праймер Рm 16SRNA- F , (20 пмоль) - 1 мкл Праймер Рm 16SRNA- R (20 пмоль) - 1 мкл ДНК Pasteurella multocida - 2 мкл Taq ДНК полимераза (5 ед) - 0,5 мкл Деионизированная стерильная вода - 38,5 мкл Амплификацию специфического участка проводили на термоциклере Mastercycler gradient при следующих режимах: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

По завершению наработки ДНК, полученные пробы детектировали электрофорезом в 2 % агарозном геле, приготовленном на ТБЕ буфере в присутствии бромистого этидия.

Полученные результаты представлены на рисунке 20.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
370
370 п.о.

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1-10 – буферные системы.

Рисунок 20 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК Pasteurella multocida в различных буферных системах и разных режимах

Из полученных результатов видно, что при использовании буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента. При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., представленный на рисунке яркими и четкими полосами. Существенных различий при использовании буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) не наблюдается. По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более высокой рН и использование данных концентраций MgCl2 и KCl приводит к ингибированию реакции.

Ферменту Taq-полимеразе при проведении ПЦР отводится основная роль. Концентрация фермента в реакции подбирается в зависимости от индивидуальной ДНК мишени или праймеров. Если концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется не достаточное количество амплификата. При подборе оптимальной концентрации брали активности фермента в реакционной смеси от 0,05 ед до 0,5 ед/50 мкл, и детектировали результаты амплификации гельэлектрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рисунке 21.

М 1 2 3 4 5 6
370п.о

Примечание - 1 – 0,05 ед; 2 – 0,1 ед; 3 – 0,2 ед; 4 – 0,3 ед; 5 – 0,4 ед; 6 – 0,5 ед; M –маркер "Direct Load^TM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о."

Рисунок 21 - Оптимизация концентрации Taq ДНК-полимеразы в реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР

Как видно из рисунка 21 концентрация Taq ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта: с повышением концентрации фермента в реакционной смеси интенсивность полос увеличивается, что свидетельствует о достаточной концентрации ДНК. При активности фермента всего 0,05 ед нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в разрабатываемой тест-системе полимераза является самым дорогим компонентом. Поэтому для разрабатываемой нами реакции мы выбрали наименьший расход фермента – 0,05 ед.

Специфичность и эффективность синтеза копий нуклеиновых кислот в ходе ПЦР зависят не только от качества и свойств ДНКполимеразы. Огромное значение придается и качеству других компонентов реакционной смеси. Mg²⁺ необходим для функционирования Taq - полимеразы. Чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона в рамках 0,5-2,5 мМ оптимальную концентрацию магния устанавливали путем титрования. Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM так как 10mM - ингибирует полимеразу на 40-50%. Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход ПЦР продукта, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.

Результаты представлены на рисунке 22.420п.н. 2 3 4 5