Таблица 14 - Комплект реагентов для постановки ПЦР при выявлении ДНК Pasteurella multocida
| Наименование компонентов в наборе | Объем компонен та (мкл) | Тип упаковки | Количество пробирок (шт.) |
|---|---|---|---|
| Комплект реагентов для выделения ДНК | 500 | Пластиковый флакон объемом 50,0 см3 | 1 |
| Раствор смеси специфических праймеров Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R, по 20 пмоль | 100 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| Раствор смеси нуклеозидтрифосфатов (дНТФ), 10 мМ | 100 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| Раствор термостабильной ДНК полимеразы (Taq- полимераза), 5 Ед/мкл | 50 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| Раствор: неинфекционная ДНК Pasteurella multocida (положительный контроль), 10 мкг/мл | 500 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| 10х ПЦР-буфер Стерильная ПЦР-вода | 400 800 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 2 5 |
Одним из компонентов, используемых при постановке реакции ПЦР, является вода, к которой предъявляются очень большие требования. Воду готовили в системе высокой очистки Milli RO и Milli Q фирмы Labconco, обеспечивающей качество воды в 16 МОм и отсутствие микроорганизмов. Деионизированную воду разливали в пробирки и автоклавировали. Все компоненты хранятся при минус 20 0С.
Прежде всего, работоспособность созданной ПЦР тест-системы была протестирована на вакцинных и вирулентных штаммах Pasteurella multocida, которыми располагает музей микроорганизмов лаборатории противобактериозной биотехнологии. Результаты одного из опытов по испытанию тест-системы для выявления ДНК Pasteurella multocida представлены на рисунке 26.
370 п.н.
Примечание - 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 , 2 - ДНК Pasteurella multocida эпизоотический штамм; 3 – ДНК Pasteurella М 1 2 3 multocida эпизоотический штамм, М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-1000 bp".
Рисунок 26- Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК разных штаммов Pasteurella multocida методом ПЦР 370 п.н.
Результаты испытаний показали, что в пробах 1, 2, и 3 нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., что указывает на присутствие в исследуемых пробах ДНК Pasteurella multocida. В то время как в отрицательной контрольной пробе каких-либо продуктов амплификации обнаружено не было.
Следующим шагом, разработанный опытный вариант ПЦР тестсистемы опробовали на патологическом материале. Образцы проб органов павших и вынужденно убитых телят с подозрением на пастереллез были доставлены из Илийского района Алматинской области. Из полученных органов была приготовлена 20 % суспензия, затем выделена ДНК Pasteurella multocida с использованием протеиназы К и ДСН. Проводили ПЦР используя оптимизированные условия. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 27.
М 1 2 3 4 5 6 7
370 п.о
пппп о мп о п оМ 1 2
3 370 п.н. 4 5
Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 (положительный контроль) , 2-8 - 20 % суспензия органов (легкие, сердце) от павших телят из Илийского района Алматинской области от 26.07.2004 г, 9 – отрицательный контроль.
Рисунок 27 - Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК Pasteurella multocida из патологических материалов методом ПЦР
Из рисунка 27 видно, что на дорожках 2 - 8 образуются полосы, лежащие на одном уровне с положительным контролем. Данный факт позволяет заключить, что во всех исследуемых пробах методом ПЦР с последующей детекцией электрофорезом выявлено ДНК Pasteurella multocida.
Таким образом, результаты испытаний показывают, что разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных штаммов, также и из патологических материалов.
2.7 Использование метода ПЦР для обнаружения ДНК Pasteurella multocida у больных животных из неблагополучных по пастереллезу хозяйств
В июле 2012 года произошла энзоотическая вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота, принадлежащих АО «Север» Мендыкаринского района. У нескольких животных в группе проявились клинические признаки болезни: угнетение, отсутствие
