показали, что отработанный метод ПЦР обладает высокой чувствительностью.
Результаты наших исследований по определению чувствительности не уступают аналогичным работам зарубежных ученых. Значение порога чувствительности 0,5 пг в пробе и сокращение времени проведения диагноза повышают диагностическую ценность отработанного метода.
2.5.4 Определение специфичности ПЦР при пастереллезе КРС Чувствительность и специфичность - основные достоинства, определяющие преимущество метода ПЦР по сравнению с традиционными методами. Специфичность метода ПЦР основана на уникальности ДНК, поэтому многократно превосходит другие методы диагностики, в том числе ИФА.
Дальнейшие исследования проводили по определению специфичности разработанной нами и оптимизированной ПЦР. В работе Chang P.C и Lee Y. специфичность ПЦР проверяли, используя ДНКобразцы, выделенные из Haemophilus influenzae и Escherichia coli, В. pertussis. Ни в одном из образцов не нарабатывались специфические продукты, что доказывало высокую специфичность метода. В своей работе Townsend K.M специфичность метода проверял, используя бактериальные инфекции, симптомы которых очень похожи между собой, и другими методами эти инфекции дифференцировать очень трудно [189]. В экспериментах использовали ДНК штамма Pasteurella multocida 90.
ПЦР-продукт размером 372 п.о. нарабатывался только в пробах, содержащих ДНК Pasteurella multocida.
Для определения специфичности ПЦР в наших экспериментах использовали штаммы Escherichia coli, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Listeria monocitogenes, Brucella abortus, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Lysteria monocytogenes
В качестве положительного контроля при постановке ПЦР использовали ДНК Pasteurella multocida штамм 90, в качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Результаты исследований представлены на рисунке 25.
370 п.н.
М – маркер «Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о.», 1- контроль (Н2О), 2,3 - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida, 4 - ДНК Escherichia coli ; 5 - ДНК Salmonella typhimurium; 6,7 – ДНК Pasteurella multocida штамм К1 и К2; 8,9 - ДНК Pasteurella multocida из органо-тканевого материала, 10 - ДНК Salmonella Dublin, 11 - Brucella abortus, 12 - Mycobacterium bovis, 13 – ДНК Listeria monocitogenes. Рисунок 25 - Электрофореграмма продуктов амплификации при использовании праймеров Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R
Как видно из рисунка 25 только в пробах, содержащих ДНК Pasteurella multocida нарабатываются специфические продукты реакции размером около 372 п.о. (2-4, 9, 11-14). Отрицательные результаты были получены при использовании в качестве матриц ДНК Escherichia coli (4), Salmonella typhimurium (5), Listeria monocitogenes (13), Mycobacterium bovis (12), а также при использовании в качестве матриц ДНК Salmonella Dublin, Brucella abortus. Отсутствие каких-либо продуктов амплификации наблюдается и с деионизированной водой (1). Полученные результаты демонстрируют специфичность разработанного нами метода.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР.
2.6 ПЦР тест-система для выявления ДНК
На основании результатов разработанного метода ПЦР был составлен опытный образец тест-системы для выявления пастереллеза КРС в биологическом материале, с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. Состав основных компонентов набора, необходимых для постановки реакции ПЦР: буфер для проведения реакции, специфические олигонуклеотиды (праймеры),
ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, стерильная ПЦР-вода и контрольная ДНК.
Термостабильная ДНК полимераза (Taq DNA Polymerase) и смесь дНТФ являются коммерческими препаратами и приобретаются в готовом виде.
Объем составных компонентов реакции рассчитывался из расчета на проведение 100 тестов, т.е. анализа 100 проб, как исследуемых образцов, так и положительных и отрицательных контролей. В таблице 11 представлены комплект реагентов для проведения ПЦР по обнаружению ДНК Pasteurella multocida.
Состав10х ПЦР-буфер: 100 мM Трис HCl, pH 8,3, 15 мM MgCl2, 750 мM KCl. Данный рабочий буферный раствор был подобран при оптимизации метода ПЦР. Для приготовления буфера использовали стерильную деионизированную воду и химические реагенты высокой чистоты.
Специфические праймеры, используемые при выявлении ДНК Pasteurella multocida, были сконструированы после компьютерной обработки полного генома Pasteurella multocida программой DNASIS MAX 1.0. Подобранные праймеры синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909 фирмы Applied Biosystems.
Раствор синтезированных праймеров предварительно высушивали на ротационном испарителе и растворяли в деионизированной воде. С целью очистки праймеры переосаждали спиртом и осадок олигонуклеотидов перерастворяли в стерильной воде до конечной концентрации 20 пмоль.
В качестве положительного контроля мы предлагаем использовать ДНК штамма 90 Pasteurella multocida. Используемую в качестве положительного контроля ДНК Pasteurella multocida получали по методике, отработанной в лаборатории и представленной в разделе материалы и методы. На конечном этапе выделения ДНК растворяли в ТЕ буфере до конечной концентрации 10 мкг/см3 .
