амплификации. Формамид обычно используется для увеличения специфичности ГЦ богатых матриц. Глицерин – для стабилизации полимеразы и понижения температуры необходимой для разделения нитей, бетаин – оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов, температуры плавления различных матриц становятся более близкими). Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую температуру отжига праймеров. Нитевой связующий белок используется для стабилизации однонитевой ДНК, ускоряет процесс отжига комплиментарного праймера к ДНК-образцу. В наших экспериментах в качестве добавочных компонентов использовали сахарозу, тритон Х- 100, глицерин, бетаин и нитевой связующий белок. В качестве контроля в реакционную смесь вносили деионизированную воду. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 23.
М 1 2 3 4 5 6 М
370 п.н.
Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1 -бетаин , 2 - нитевой связующий белок , 3 - глицерин, 4 - тритон Х-100, 5 - сахароза, 6 - деионизированная вода (контроль). Рисунок 23 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК Pasteurella multocida с различными добавками
На представленной электрофореграмме видно, что внесение добавочных компонентов (глицерина, тритона Х-100) в основной буфер приводит к ингибированию реакции. Незначительное положительное влияние на амплификацию специфического продукта оказало добавление 5% сахарозы, по видимому, за счёт стабилизации фермента, что видно при сравнении с контролем. Добавление бетаина и нитевого связующего белка существенного влияния на процесс амплификации не оказывает. Основываясь на вышеперечисленных результатах, мы не стали включать добавочные компоненты в рабочий буферный раствор.
Таким образом, результаты экспериментов по оптимизации концентрации компонентов реакционной смеси позволили использовать реакционную смесь следующего состава (50 мкл): х10 ПЦР буфер (100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP (10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,05 ед Taqполимеразы в конечной концентрации.
После того как были отработаны основные этапы метода ПЦР, мы определили время, которое затрачивается на стадии проведения реакции и детекцию. Для постановки диагноза достаточно 1ч 25 минут.
В последние время одной из основных тенденций развития метода ПЦР и его модификаций является сокращение времени проведения анализа. Данный факт очень важен при проведении исследований во время возникновения вспышек инфекции и в затруднительных ситуациях при постановке диагноза традиционными методами. Далее был проведен сравнительный анализ условий временного режима с аналогичными работами, представленными в литературе. В работе Miflin J.K., Blackall P.J. [196] на 1 цикл ПЦР затрачивается 3 минуты, что в 3 раза увеличивает время проведения исследований при сравнении температурно-временным режимом настоящей работы. Townsend K..M и др. [206] синтезировал специфический участок размером 372 п.о. при 720 С в течение 2 минут. Результаты наших исследований показывают, что для работы сконструированных нами специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта размером 372 п.о. для отжига и синтеза достаточно по 20 секунд, соответственно. При сопоставлении с работой Townsend K..M температурно-временной режим сокращается в 4 раза и тем самым значительно уменьшается общее время проведения исследований. При сравнении ПЦР условий, предложенными Афонюшкиным В.Н., [218], в отработанном нами методе на каждый цикл реакции требуется на 30 секунд меньше. Это позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida в более короткий срок.
Полученные нами результаты делают отработанный метод ПЦР наиболее эффективным, который позволяет увеличить скорость постановки диагноза.
2.5.3 Определение чувствительности ПЦР при диагностике пастереллеза
Одним из главных достоинств ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность.
После определения основных параметров разрабатываемого метода ПЦР для диагностики пастереллеза КРС, были проведены эксперименты по определению чувствительности данного метода. При изучении чувствительности ПЦР использовали разработанные оптимальные температурные и временные условия реакции. В наших
экспериментах для выявления ДНК Pasteurella multocida использовали различные разведения ДНК штамма 90 Pasteurella multocida. Для проведения ПЦР делали 10-ти кратные разведения ДНК бактерии от 500 нг до 0,05 пг. Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 20.
В работе Nagai S, чувствительность метода ERIC -ПЦР для диагностики пастереллеза с использованием праймеров на участок toxA гена достигала всего 25 пг [166]. Порог чувствительности метода геномных «отпечатков пальцев» ПЦР в работах индийских ученых составил 1-10 фг [173,176].Чувствитеьность метода геномных «отпечатков пальцев» на порядок выше. Метод ПЦР разработанный Saxena MK, et al.при диагностике пастереллеза позволяет выявлять ДНК пастерелл в количестве 500 нг-50 фг в пробе [164].
Таким образом, по литературным данным, порог чувствительности различных модификаций метода ПЦР для выявления ДНК Pasteurella multocida варьирует в пределах 50 пг-50 фг.
370 п.н.
Примечание - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida в концентрациях: 1 – 500 нг; 2 – 50 нг; 3 – 5 нг; 4 – 500 пг; 5 – 50 пг; 6 – 5 пг; 7 – 0,5 пг; 8 –0,05 пг. М – маркер ДНК “Direct LoadTM Wide Range DNA Marker, 50 – 10000 bp”.
Рисунок 24 - Определение чувствительности ПЦР при выявлении ДНК Pasteurella multocida
Как видно из рисунка 24 чувствительность метода ПЦР составила 37 0,5 пг ДНК Pasteurella multocida в пробе. Результаты экспериментов 370 п.н.
