Как видно из рисунка в косопроходящем свете колонии имеют радужное свечение, что связано с капсулообразованием. При длительном хранении культур происходила диссоциация, в результате чего S-форма колоний переходила в R и М - формы. R-форма представляет собой непрозрачные с шероховатыми краями колонии, а М-форма (мукоидная) слизистые, с неровными краями колонии. Также, при изучении культуральных свойств, производили посевы пастерелл в бульон Хоттингера и МПБ (рисунок 9).

Как видно из рисунка при культивировании пастерелл в бульоне Хоттингера и МПБ штамм Pasteurella multocida 90 давал типичный рост, вызывая равномерное помутнение среды с образованием незначительного осадка на дне культивируемого сосуда, при встряхивании отмечаются муаровые волны, по мере старения культуры происходит просветление среды с образованием слизистого осадка на дне пробирки, поднимающегося при встряхивании в виде косички. Штамм Pasteurella multocida 90 обладает специфическим запахом, не образуют пленку и пристеночного кольца

Данные результатов изучения биохимических свойств Pasteurella multocida 90 отражены в таблице 3.

Таблица 5 – Биохимические свойства штамма Pm 90

Как видно из данных таблицы 5, штамм ферментирует без образования газа: глюкозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, сорбит, показал вариабельность в отношении маннита, не ферментирует лактозу, ксилозу, арабинозу, восстанавливает нитраты в нитриты, обладает каталазной активностью, образовывает индол, сероводород, не вызывает гемолиз эритроцитов. Согласно определителю бактерии Bergey^| s (1984) тесты на индол и гемолиз эритроцитов являются основными показателями для определения вида у представителей рода Pasterella, то есть служат для дифференциации P.multocida от P.haemolitica. P.multocida - 90 также не разжижает желатин, не свертывает молоко.

Далее нами были изучены вирулентные свойства эталонного штамма P.multocida 90 на белых мышах с массой 18-20 г. (таблица 6) с определением ЛД50 путем внутрибрюшинного введения вирулентной культуры пастерелл 50 КОЕ, 100 КОЕ и 150 КОЕ.

Таблица 6 - Вирулентные свойства эталонного штамма P.multocida 90 на белых мышах

Из таблицы видно, что вирулентность эталонного штамма P.multocida 90 для белых мышей составило 50-150 КОЕ. Таким образом, для эпизоотических и музейного штаммов пастерелл характерными являются: полиморфизм, отрицательная окраска по Граму, выраженная биполярность при окрашивании по Романовскому-Гимзе, наличие капсулы при окраске по Михину, рост в аэробных условиях на обычных питательных средах, но лучше с добавлением сыворотки лошади, образование на плотных питательных средах гладких S-форм колоний с радужным свечением в косопроходящем свете, рост на МПБ, бульоне Хоттингера сопровождающиеся помутнением среды с последующим просветлением с образованием слизистого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде косички, способность образовывать индол и сероводород, не способность гемолизировать эритроциты, вариабельность биохимических свойств. Все исследованные штаммы пастерелл обладают вирулентными свойствами.

2.3 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida

2.3.1 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из бактериальных культур

Нами проведены исследования по отработке оптимальных методов экстрагирования бактериальной ДНК. При диагностике пастереллеза КРС методом ПЦР основным рабочим материалом, как уже упоминалось, является ДНК Pasteurella multocida. Основным критерием в методах выделения ДНК является то, что нуклеиновая кислота должна быть максимально очищенной от примесей клеточных ДНК и белков. Выделенная геномная ДНК должна нефрагментированной, так как она служит матрицей для синтеза специфического продукта.

Как известно, в прокариотической клетке генетический материал (ДНК) локализован в довольно неупорядоченном, не окруженном мембраной тельце, называемом нуклеоидом . Для исследования свойств нуклеиновой кислоты бактерии в растворе необходимо выделить ее из бактериальной клетки. Для этого используют такие методические приемы, которые позволяют разрушить различного типа связи между субъединицами белковой оболочки бактериальной частицы, между нуклеиновой кислотой и белком. В методическом сборнике «PCR Protocols» наиболее часто для выделения нативной ДНК прокариотов рекомендуют детергентно-ферментные методы с последующей экстракцией фенолом [223]. Детергенты - растворимые в воде полярные липиды. Обычно они классифицируются по типу гидрофильной группы: анионные, катионные, амфотерные и неионные. Ионные детергенты (Nonidet P-40, Тween 80) лучше денатурируют белки, чем неионные.

Townsend KM, Frost AJ, Lee CW, Papadimitriou JM, Dawkins HJ. [206] в своих работах описывают метод экстракции ДНК с использованием детергента Тween 20. Carol A. Lichtensteiger, Susan M. Steenbergen в статье “Direct PCR Analisis for Toxigenic Pasteurella multocida” [224] остановились на методе изоляции ДНК Pasteurella multocida с использованием детергента Nonidet P-40.

В наших исследованиях по подбору оптимальной схемы выделения ДНК из культур Pasteurella multocida были использованы следующие методы:

• детергентно-ферментный метод с использованием додецилсульфата с последующей экстракцией фенол/хлороформом;

• с применением детергента и последующей экстракцией фенолом.

• использование лизирующего буфера, содержащий и с дальнейшей экстракцией фенол/хлороформом;

• метод кипячения.