Из рисунка 19 видно, что при проведении синтеза в течение 10-15 секунд амплификаты отсутствуют. За 20 секунд нарабатывается ПЦРпродукт c очень низкой специфичностью. При проведении синтеза от 25 до 60 секунд в пробах нарабатывается достаточное количество ПЦРпродукта размером 165 п.о. Таким образом, полимераза полностью достраивает вновь синтезированные комплиментарные цепи ДНК за 30 секунд. В дальнейших экспериментах синтез ПЦР-продукта проводили в течение 30 секунд.

На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР:

пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

2.5.2.2 Подбор оптимальных условий проведения ПЦР

Концентрация MgCl2, KCl и рН буфера в значительной степени определяют специфичность и чувствительность ПЦР. В случае изменения параметров буфера для ПЦР происходит качественное или количественное изменение получаемого амплификата.

Концентрация MgCl2 влияет на отжиг праймеров, денатурацию образца, кроме того, MgCl2 необходим для поддержания активности Taq-полимеразы. Однако, избыток хлорида магния может вызывать получение неспецифического амплификата.^{Трис-HCl и KСl} обеспечивают необходимую ионную силу и рН смеси. Хлорид калия является активатором ПЦР и его добавляют для улучшения отжига праймеров. Предельной концентрацией KСl является 50 мМ, так как последующие увеличение может привести к ингибированию полимеразы [223].

Оптимизация концентраций MgCl2 , KСl и рН буфера может приводить к уменьшению выхода неспецифического продукта и увеличению выхода амплификата. Рабочие концентрации перечисленных выше соединений подбираются экспериментальным путем в процессе оптимизации условий реакции. Данную задачу значительно облегчают имеющиеся на сегодняшний день наборы для оптимизации ПЦР.

Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР был использован набор для оптимизации ПЦР – "PCR Optimization Kit II" фирмы "Sigma".

10 буферных растворов которые, были апробированы в ходе работы, различались концентрацией хлористого магния и калия, а также величиной рН.

Состав буферных систем приведен в таблице 13.

Таблица 13 – Состав буферных растворов, используемых при оптимизации ПЦР

Использовали реакционную смесь для амплификации ДНК объемом 50 мкл следующего состава:

х50 универсальный буфер (20 мМ ТрисHCl, pH 8.0, 250 нМ ЭДТА - 1 мкл х10 (один из 10 буферов) ПЦР буфер - 5 мкл 10 мМ dNTP mix - 1 мкл Праймер Рm 16SRNA- F , (20 пмоль) - 1 мкл Праймер Рm 16SRNA- R (20 пмоль) - 1 мкл ДНК Pasteurella multocida - 2 мкл Taq ДНК полимераза (5 ед) - 0,5 мкл Деионизированная стерильная вода - 38,5 мкл Амплификацию специфического участка проводили на термоциклере Mastercycler gradient при следующих режимах: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

По завершению наработки ДНК, полученные пробы детектировали электрофорезом в 2 % агарозном геле, приготовленном на ТБЕ буфере в присутствии бромистого этидия.

Полученные результаты представлены на рисунке 20.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
370
370 п.о.

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1-10 – буферные системы.

Рисунок 20 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК Pasteurella multocida в различных буферных системах и разных режимах

Из полученных результатов видно, что при использовании буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента. При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., представленный на рисунке яркими и четкими полосами. Существенных различий при использовании буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) не наблюдается. По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более высокой рН и использование данных концентраций MgCl2 и KCl приводит к ингибированию реакции.

Ферменту Taq-полимеразе при проведении ПЦР отводится основная роль. Концентрация фермента в реакции подбирается в зависимости от индивидуальной ДНК мишени или праймеров. Если концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется не достаточное количество амплификата. При подборе оптимальной концентрации брали активности фермента в реакционной смеси от 0,05 ед до 0,5 ед/50 мкл, и детектировали результаты амплификации гельэлектрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рисунке 21.