А - Программа, где для отжига праймеров использовали температуру- 520 С.
Б - Программа, где для отжига праймеров использовали температуру - 570 С.
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.).
Из рисунка видно, что при отжиге праймеров при 520 С не получены никакие сигналы амплификации. При температуре 570 С произошел слабый отжиг праймеров PfhB1, вследствие чего нарабатывался незначительное количество ПЦР - продукта.
В следующем эксперименте попробовали увеличить температуры отжига. При температуре 580 С выход продукта начинал резко снижаться, что обусловлено превышением значения критической температуры для данных пар праймеров. Поэтому, в дальнейших экспериментах использовали температуру отжига 570 С.
При проведении следующего эксперимента учитывали важный момент: если ДНК взята в избытке, то при амплификации могут появиться неспецифические фрагменты продуктов амплификации. Поэтому, полученный нашими методами ДНК пастерелл разводили до 1000 раз. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме:
пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 30 с, 950 С отжиг: 30 с, 570 С 30 циклов синтез: 30 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
Использовали реакционную смесь следующего состава (300 мкл на 12 образцов):
Таблица 12- Состав реакционной смеси с праймерами omp 87, pfhB1, tadD
| Компонент | Объем на один образец | Объем на 12 образцов |
|---|---|---|
| KCl | 2,5 мкл | 30 мкл |
| dNTP | 0.5 мкл | 6 мкл |
| F праймер (omp87, pfh) | 0,5 мкл | 6 мкл |
| R праймер | 0,5 мкл | 6 мкл |
| Taq полимераза | 0,5 мкл | 6 мкл |
| MgCl2 | 1,0 мкл | 12 мкл |
| Деионизированная вода | 14,5 мкл | 174 мкл |
| ДНК | 5 мкл | 5 мкл |
Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 18.
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.)..
Из рисунка 18 видно, что при использовании праймера pfhB1 на дорожках 3и 4 образовались полосы, размером 165 п.н.
Для дальнейших исследований использовали праймеры на участок гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5-TGCGAGTATTACGCTACAAG-3 и Pm РfhB1 – R -5-TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3
При проведении ПЦР большое значение имеет фермент – полимераза, которая работает с комплексом элонгации (праймер и матрица ДНК). Элонгация – этап, на котором происходит основной синтез ДНК. На данный момент известно, что существует три класса
полимераз. Фермент выбирается в зависимости от размера специфического продукта. В наших исследованиях длина ПЦР-продукта составляет порядка 165 п.о. Рекомендуемой полимеразой при синтезе более 1000 п.о. является Taq-полимераза. Для работы Taq-полимеразы, в основном используют температуру 720 С, так как при этой температуре полимеразная активность максимальна. Однако температура 720 С приемлема не для всех случаев. При проведении эксперимента учитывали важный момент: если матрица взята в избытке, то полимераза будет "пренебрегать" неудобными участками для синтеза ДНК. В реальном процессе полимеразе необходимо пройти все имеющиеся в наличии участки.
Время синтеза определяется скоростью работы Taq-полимеразы и длиной амплифицируемого фрагмента. При расчётах учитывали, что для синтеза продукта размером 1000 п.о. необходима 1 минута, чтобы достроить вновь синтезированные комплементарные цепи ДНК. Введение же в конце дополнительного времени синтеза (10 мин) при 72 0С обеспечивает завершение синтеза всего имеющегося неполного амплификата.
В процессе исследований было изучено влияние продолжительности синтеза на наработку ПЦР продукта. Сокращение времени синтеза, позволяет сократить время постановки диагноза. Поэтому, при отработке параметров метода ПЦР большое значение было уделено экспериментальной оптимизации времени синтеза для амплификации продукта размером 165 п.о. Первоначально синтез проводили в течение 1 мин, далее уменьшали время на каждые 10 секунд. Результаты исследований представлены на рисунке 19.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 19 - Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием праймеров pfhB1 при различной продолжительности синтеза
М – маркер ДНК "50 bp DNA Ladder." BioLabs ", 1 – отрицательный контроль, 2 – 10 с. синтез, 3 – 15 с., 4 – 20 с., 5 - 25 с., 6 – 30 с., 7 – 40 с, 8 – 50 с, 9 – 60 с.
