Диагностика пастереллеза крупного рогатого скота методом ПЦР

аппетита, высокая температура. Из патматериала от 2 голов вынужденно забитых коров бактериологически был установлен пастереллез.

У всех животных данной группы (22 головы) была взята кровь для исследования методами ИФА и ПЦР (таблица 15). Для исследования методом ИФА использовали набор для выявления антител к пастереллезу животных фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).

Таблица 15 – результаты сравнительных исследований крови КРС

Как видно из таблицы, бактериологически был исследован материал только от 2 голов животных. При исследовании методом ИФА выявлено 9 положительных проб. При исследовании методом ПЦР - 11 положительных проб. Метод ПЦР можно применять для выявления пастереллоносителей в хозяйствах.

2.8 Разработка способа отбора и доставки патологического материала при пастереллезе крупного рогатого скота для исследования методом полимеразно-цепной реакции

Качественное взятие и доставка материала является одним из стандартизирующих и предопределяющих моментов всего лабораторного исследования. Особое значение имеет стандартизация

процесса транспортировки проб в лабораторию. Общее правило: доставить материал в лабораторию как можно быстрее. При транспортировке учитывается стабильность отдельных проб для исследований в зависимости от времени, температуры, воздействия прямого света.

Для ПЦР исследования способы доставки биологического материала разработаны в общих чертах. В методических рекомендациях «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦРдиагностики» (Москва, 2003), способ доставки носовых и ротовых истечений для исследования на пастереллез также не описан. Главным условием предложенных в рекомендации способов является свежесть, быстрота доставки материала для исследования, что не всегда бывает возможным. В Республике Казахстан методики по забору, транспортировке патологического материала для исследования методом ПЦР не разработаны. Поэтому в процессе работы перед нами стояла задача разработки способа доставки истечений из носовой и ротовой полостей для исследования методом ПЦР, который бы продлевал сроки транспортировки биоматериала.

Сущность разработанного нами способа доставки носовых и ротовых истечений заключается в следующем: в слюне и носовой слизи содержатся ферменты, выполняющие бактериолитические функции: лизоцим, протеазы, пептидазы, щелочная и кислая фосфатазы, РНКазы. Вместе с бактерией лизируется и бактериальная ДНК. Для проведения ПЦР анализа необходимо наличие нефрагментированной геномной ДНК, так как она служит матрицей для синтеза специфического продукта.

Истечения для исследования брали стерильными ватными тампонами и помещаются в стерильную одноразовую пробирку с 0,9% физиологическим раствором. Пробирки с пробами истечений выдерживаются в кипящей водяной бане в течение 10 минут, в результате чего разрушаются ферменты слюны и носовой слизи, тем самым устраняется их лизирующее действие, также лизируются бактериальные клетки и выделяется ДНК. Затем в пробирки добавляется 96% этиловый спирт в соотношении 1 : 4. Выделенная ДНК консервируется этиловым спиртом, что продлевает срок доставки истечений для исследования на пастереллез до 24 часов. Преимущество данного способа заключается в том, что увеличивается срок доставки материала для исследования до 24 часов при комнатной температуре.

При исследовании крови и носовых и ротовых истечений доставленных от больных животных п. Прогресс, с/о Айдарлы, п. Челгаши Карасуского района в года не удавалось выделить

качественную ДНК, так как из-за дальности расстояния пробы материала доставлялись в течение 8 -12 часов.

В КХ «Дастан» с/о Тастинский Амангельдинского района произошла вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота. В хозяйстве пали 2 коровы, у 8 голов крупного ргатого скота наблюдались клинические признаки болезни. В лабораторию через 12 часов было доставлено для исследования методом ПЦР 10 проб крови, консервированных 3% раствором ЭДТА, кусочки органов от павших коров в термочемоданах и 5 проб истечений из ротовой и носовой полостей, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4 (рисунок 28).

Примечание – 1 – 5 дорожки – ДНК носовых истечений, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4; 6 - ДНК крови, консервированной 3% раствором ЭДТА; 7 – ДНК из органов, доставленных в термочемоданах.

Рисунок 28 – Электрофореграмма проб материала из КХ «Дастан» доставленных через 12 часов

Как видно на фореграмме при проведении электорофореза выделенных ДНК органов, доставленных в неконсервированном виде в термочемоданах и консервированной крови не удавалось выделить качественную ДНК, если с момента взятия пробы проходило больше 10 часов. Электрофореграммы показывали лишь шмеры.

В процессе экспериментов нами проводилось выделение ДНК из проб истечений доставленных из хозяйств «Викторовское» Тарановского района, ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского