10 % ДСН, 10 мг/см3 этидиум бромида, 2 % ФВК, рН 6,8, 1 М KOH, 10 мг/см3 протеиназа К, 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 96 % и 70 % этанол. TВE: 89 мМ Трис-борат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА
| ТАЕ : | 40 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА |
|---|---|
| ТЕ: | 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА |
| Протеиназный буфер: | 0,3 М NaCl, 25 мМ ЭДТА, 2 % ДСН, 0,2 М трис-HCl, рН 7,5 |
| Буфер для проб (2): | 100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, |
|---|---|
| 20 % (в/о) глицерин, | |
| 4 % (в/о) ДСН, | |
| 0,001 % (в/о) БФС, | |
| 2 % (о/о) 2-меркаптоэтанол, |
| Электрофорезный | буфер | 125 мМ | Трис-HCl, 0,5 % (в/о) ДСН, |
|---|---|---|---|
| (5): | 0,96 М | глицин |
| Буфер для нанесения проб: | 80 % (о/о) формамид, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,1% (в/о) бромфеноловый синий, 0,1% (в/о) ксиленцианол |
|---|---|
| 4х Трис-Cl/ДСН, рН 8.8 | 1,5 M Трис довести рН до 8,8 1n NaCl, 0,4 % ДСН |
| Буфер для ПЦР | 100 мM Трис HCl, pH 8,3, 15 мM MgCl2, 750 мM KCl |
| Буфер для отжига (×5): | 200 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl |
Оборудование:
-
синтезатор олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems;
-
термоциклер с градиентом температур Mastercycler gradient;
-
УФ бокс UVS/ T-M, Латвия;
-
РНК/ДНК калькулятор GenQuant Pro RNA/DNA Calculator,
-
Amersham-Pharmacia-Biotech;
-
аналитические весы AB 204-5/A, Mettler Toledo;
-
рН-метр Delta 320 Mettler Toledo;
-
универсальная цифровая система документации Infinity 115;
-
термоплаты Thermomixer compact, Eppendorf;
-
шейкеры, вортексы Vortex Genie 2 Shaker, МультиСпин MSС -
-
3000;
-
автоматические микропипетки, Eppendorf;
-
аппарат для горизонтального электрофореза нуклеиновых кислот
-
HU 25, Scie - Plas;
-
цифровой фотоаппарат для фотографирования гелей, Olympus;
-
пакет прикладных программ для анализа последовательностей ДНК
-
- DNASYS MAX 1.0, Sequencher, Vector NTI, BioEdit, GENEDOC, Staden package.
-
рефрижираторная микроцентрифуга " Centrifuge 5417R", Eppendorf
-
;
-
низкоскоростная центрифуга "Centrifuge 5702", Eppendorf;
-
микроцентрифуга "MiniSpin", Eppendorf;
-
ультразвуковой дезинтегратор "MSE-150", MSE;
-
источник питания "Electrophoresis Power Supply-EPS 3501",
-
Amersham-Pharmacia-Biotech.
Методы исследований.
Мониторинг эпизоотической ситуации по пастереллезу в Костанайской области проводили по данным ветеринарной отчетности Костанайской областной ветеринарной инспекции, Костанайского филиала РГКП «Республиканская ветеринарная лаборатория», результатам собственных исследований.
Выделение эпизоотических штаммов Pasteurella multocida проводили от больных и павших голов крупного рогатого скота из хозяйств Костанайской и Алматинской областей. Культурально - морфологические, биохимические, вирулентные свойства эпизоотических штаммов пастерелл изучали по общепринятым методикам.
Для выращивания культур штаммов пастерелл производили посевы на МПБ и МПА, питательные среды Хоттингера с добавлением 5% сыворотки лошади. Посевы инкубировали в термостате в течение 18 часов. Готовили суспензии из паренхиматозных органов, мазки из органов и крови сердца мышей, мазки из выращенных суточных культур. Мазки окрашивали по Граму, синькой Леффлера и по Романовскому - Гимза.
Биохимические свойства пастерелл изучали на средах Гисcа. Пастереллы расщепляли глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит с образованием кислоты без газа, не разжижали желатин, образовывали индол.
Выделение ДНК из бактериальной культуры Pasteurella multocida проводили обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой К.
В суточную культуру возбудителя добавляли протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/см3 , ДСН до конечной концентрации 0,5 %. Полученную смесь инкубировали при 560 С в течение 1 ч, при этом происходил лизис и выделение ДНК.
ДНК очищали двукратным экстрагированием равными объемами фенола и фенол/хлороформа. Каждую экстракцию проводили медленным переворачиванием пробирки. Фенольную и водную фазы разделяли центрифугированием при 15600 g, при комнатной температуре в течение 5 мин на центрифуге "Eppеndorff''. Конечную водную фазу отбирали и экстрагировали равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (96:4). Водную фазу отбирали и к ней добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного 96 % этанола. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при минус 200 С в течение 1 ч.
Осаждение ДНК проводили центрифугированием при 15600 g в течение 15 мин при температуре 40 С. Осадок ДНК дважды промывали 70 % этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в необходимом объеме ТЕ буфера.
Чистоту полученных препаратов ДНК определяли спектрофотометрически по отношению оптических плотностей при длинах волн 260 нм и 280 нм (Е260/Е280). Для чистых препаратов ДНК это отношение должно быть равно 1,8 и выше. Если это отношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом. В этом случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию фенол/хлороформом.
При выделениеи ДНК Pasteurella multocida из органно-тканевых материалов образцы исследуемого биологического материала (легкие, лимфоузлы) мелко нарезали с помощью скальпеля и помещали в ступки с песком. Материал растирали до образования однородной массы, и добавляли физиологический раствор для получения 20 % суспензии (вес/объём). Далее выделение бактериальной ДНК проводили по выше описанной методике.
Кровь для исследования консервировали 3% раствором трилона Б. При перхлоратном методе цельную кровь в первый день ставили на лизис:
- на 200 мкл цельной крови добавили 1 мл ТЕ буфера и перемешивали в течение 1 минуты на вортексе, затем центрифугировали при 7500 об/мин в течение 1 минуты. Затем супернатант сливали так повторяли 2-3 раза, до получения супернатанта розового цвета; аккуратно сливали верхний слой и добавляли 300 мкл лизирующего буфера и 8 мкл. протеиназы К; ставили в термостат при +630 С на 12-14 часов. На следующий день для продолжения процесса выделения ДНК в каждую пробирку добавляли реагенты: 50 мкл перхлората натрия и
