М 1 2 3 4 5 6
370п.о
Примечание - 1 – 0,05 ед; 2 – 0,1 ед; 3 – 0,2 ед; 4 – 0,3 ед; 5 – 0,4 ед; 6 – 0,5 ед; M –маркер "Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о."
Рисунок 21 - Оптимизация концентрации Taq ДНК-полимеразы в реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР
Как видно из рисунка 21 концентрация Taq ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта: с повышением концентрации фермента в реакционной смеси интенсивность полос увеличивается, что свидетельствует о достаточной концентрации ДНК. При активности фермента всего 0,05 ед нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в разрабатываемой тест-системе полимераза является самым дорогим компонентом. Поэтому для разрабатываемой нами реакции мы выбрали наименьший расход фермента – 0,05 ед.
Специфичность и эффективность синтеза копий нуклеиновых кислот в ходе ПЦР зависят не только от качества и свойств ДНКполимеразы. Огромное значение придается и качеству других компонентов реакционной смеси. Mg2+ необходим для функционирования Taq - полимеразы. Чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона в рамках 0,5-2,5 мМ оптимальную концентрацию магния устанавливали путем титрования. Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM так как 10mM - ингибирует полимеразу на 40-50%. Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход ПЦР продукта, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.
Результаты представлены на рисунке 22.420п.н. 2 3 4 5
В наших экспериментах мы изучили влияние концентрации хлорида магния, начиная с 1,5 мМ постепенно повышая концентрацию до предельного значения 4,0 мМ.
М 1 2 3 4 5 6
6666
370 п.н.
Примечание – 1- отрицательный контроль; 2 - 1,5 мМ; 3 – 2,0 мМ; 4 – 2,5 мМ; 5 – 3,0 мМ; 6 – 3,5; M- маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp"
Рисунок 22 - Оптимизация концентрации MgCl2 в реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР
Как видно из рисунка 22, изменение концентрации соли в пределах 1,5-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации. Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков. Нужно заметить, что и при концентрации MgCl2 2,5 мМ нарабатывалось достаточно большое количество специфического продукта. На основании полученных экспериментальных данных в дальнейших экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.
Дальнейшие исследования по оптимизации ПЦР проводили, используя различные, так называемые активаторы ПЦР. Соли хлорид калия в концентрации 10-50 мМ или сульфат аммония в концентрации 10-20 мМ добавляют для улучшения отжига праймера. В некоторых методиках рекомендуют использовать неионные детергенты Triton X100, Nonidet NP40 и Tween 20, 10 % в концентрации 0,05-0,1 %, буфер с сахарозой для стабилизации фермента. Однако роль денатурирующих агентов для нарушения вторичной структуры ДНК двояка: они могут не только способствовать полной денатурации матрицы, но и вызывать частичную инактивацию Taq-полимеразы и снижение выхода продукта
амплификации. Формамид обычно используется для увеличения специфичности ГЦ богатых матриц. Глицерин – для стабилизации полимеразы и понижения температуры необходимой для разделения нитей, бетаин – оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов, температуры плавления различных матриц становятся более близкими). Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую температуру отжига праймеров. Нитевой связующий белок используется для стабилизации однонитевой ДНК, ускоряет процесс отжига комплиментарного праймера к ДНК-образцу. В наших экспериментах в качестве добавочных компонентов использовали сахарозу, тритон Х- 100, глицерин, бетаин и нитевой связующий белок. В качестве контроля в реакционную смесь вносили деионизированную воду. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 23.
М 1 2 3 4 5 6 М
370 п.н.
Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1 -бетаин , 2 - нитевой связующий белок , 3 - глицерин, 4 - тритон Х-100, 5 - сахароза, 6 - деионизированная вода (контроль). Рисунок 23 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК Pasteurella multocida с различными добавками
На представленной электрофореграмме видно, что внесение добавочных компонентов (глицерина, тритона Х-100) в основной буфер приводит к ингибированию реакции. Незначительное положительное влияние на амплификацию специфического продукта оказало добавление 5% сахарозы, по видимому, за счёт стабилизации фермента, что видно при сравнении с контролем. Добавление бетаина и нитевого связующего белка существенного влияния на процесс амплификации не оказывает. Основываясь на вышеперечисленных результатах, мы не стали включать добавочные компоненты в рабочий буферный раствор.
