5'-CGATAATAACGC ||| : :: A 3'-CTAAAAGAGCT dG: 0,28 kcal/mol Primer 1 - Primer 2 annealing:

5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3' :: : ||| 3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5' dG: -0,21 kcal/mol

Таблица 9 - Подобранные праймеры для исследования

Для синтезирования праймеров была использована программа Clonemanager (http://www.scied.com/prcmpro. htm), с установкой на оптимальные параметры: температуру плавления Tmo= 58^o -62^o , длина 18-22 пар оснований (по), получаемый продукт 70-300 п.о. Допустимое количество праймеров-димеров – не более 4. Так же рассматривалось образование «шпильки», то есть отжиг с самим собой и повторные участки.

Помимо сходных температур плавления, по расчетным данным эти праймеры не должны образовывать стабильных гетеродуплексов друг с другом.

Фланкирующий праймерами участок ДНК был проверен с помощью программы BLAST (on-line free).

Результаты проверки показали, что нуклеотидная последовательность теоретически образуемого ПЦР-продукта соответствует Pasteurella multocida.

Смоделированные последовательности праймеров в дальнейшем были синтезированы на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems. Очистку праймеров проводили методом спиртового переосаждения. Полученные таким образом синтезированные праймеры разводили до концентрации 20 пмоль и использовали для проведения ПЦР.

2.5.2 Отработка и оптимизация параметров ПЦР

2.5.2.1 Подбор и отработка температурно-временного режима Очень важным и сложным этапом при разработке метода ПЦР является подбор и отработка параметров температуры и времени циклов амплификации.

Трем последовательным стадиям ПЦР: денатурации матрицы при нагревании, отжигу праймеров с одноцепочечной матрицей и синтезу второй цепи с помощью термостабильной ДНК-полимеразы соответствует определенный температурный профиль. Для каждой стадии экспериментальным путем подбирается температура и время. В общем случае температура этапа денатурации обычно выбирается между 90-95⁰ С, отжига между 40-60⁰ С, а элонгации между 70-75⁰ С. Кольцевая ДНК умеет денатурировать после тепловой денатурации. Поэтому температура и время денатурации выбираются как компромисс между двух целей: хорошо денатурировать матрицу, не сильно повредив при этом матрицу и Taq полимеразу, которые разрушаются при нагреве.

Температура, при которой денатурируется двуспиральная ДНКматрица, зависит от содержания в ней GC оснований. При высоком содержании GC оснований, для полного расхождения цепей в молекуле ДНК необходима более высокая температура. Так же более длинные матрицы ДНК требуют большей температуры для полной денатурации. Очень низкая температура денатурации, или короткая продолжительность времени денатурации приводят к тому, что участки ДНК с высоким содержанием GC оснований не расплетутся, а денатурируют только регионы богатые АТ-основаниями. Однако более продолжительное время денатурации или более высокая температура приводят к нежелательному снижению ферментативной активности полимеразы.

Эксперимент ПЦР проводили в двух температурных режимах.

В первом эксперименте использовали амплификатор Nexus,

используя следующие режимы температур: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 20 с, 94⁰ С отжиг: 20 с, 52⁰ С 30 циклов синтез: 20 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл на 12 образцов:

Таблица 10- Состав реакционной смеси с праймерами pfhB1 и tadD

Во втором эксперименте амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 20 с, 95⁰ С отжиг: 20 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 20 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл на 12 образцов:

Таблица 11 – Состав реакционной смеси с праймерами omp87, pfh

Для амплификации использовали все 3 пары праймеров: omp87, Pfh B1 b tadD. Результаты амплификации представлены в рисунке 17.