Первый способ основан на использовании фермента протеиназы К для лизиса белковых структур с дальнейшей фенольной депротеинизацией. Второй способ экстракции ДНК из бактерий предусматривает использование в качестве детергента Тween - 20. Тween хорошо лизирует клеточную мембрану, но слабее действует на ядерную стенку, если учесть, что в бактериальных клетках ядро не имеет оболочки – это оптимальный вариант.
При применении третьего метода в качестве детергента использовали Nonidet P-40. Главными критериями при отработке оптимальных методов были концентрация и чистота препарата.
После выделения ДНК Pasteurella multocida вышеперечисленными методами проводили качественный и количественный анализ образца. Электрофорез проводили в 0,8 % агарозном геле в ТАЕ-буфере. Спектрофотометрически измеряли отношение между оптическими плотностями при 260 и 280 нм. Максимум поглощения для нуклеиновых кислот регистрируется при длине волны 260 нм. Препарат ДНК считается свободным от примесей при величине отношений Е260/280 равным 1,8 и выше. Если этот показатель ниже указанного, то образец загрязнен белками или фенолом.
Образцы ДНК Pasteurella multocida, полученные с использованием детергентов Nonidet P-40 и Тween - 80, оказались невысокого качества. Отношения между оптической плотностью при длинах волн 260 и 280 нм в среднем составляли 1,65-1,7, что говорило о загрязненности ДНК белком и другими примесями. Таким образом, полученные результаты показали неэффективность этих методов.
Лучшие результаты были получены при обработке бактериосодержащей суспензии детергентом – 10 % раствором додецилсульфата натрия в сочетании с протеиназой К и с последующей экстракцией фенол/хлороформом. Применение додецилсульфата натрия не только депротеинизирует бактериальную клетку, но также подавляет активность нуклеаз. Клеточные белки удаляли обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой К. Для удаления белков и разрыва связей ДНК-белок использовали смесь фенол-хлороформ, который является более сильным средством депротеинизации. Результат качественного анализа полученного препарата ДНК представлен на электрофореграмме (рисунок 10).
Примечание - 1 – геномная ДНК Y.enterocolitica; М – маркер ДНК ". Рисунок 10 - Электрофореграмма геномной ДНК штамма Y.enterocolitica,
Как видно из рисунка ДНК Pasteurella multocida представлена одной четкой линией, что говорит о нативности препарата. Оптимальная схема выделения ДНК Pasteurella multocida при использовании данного метода представлена на рисунке 11.
Инкубация суточной культуры
Pasteurella multocida с протеиназой К
(к/к 100 мкг/см 3 и 0,5 % SDS).
Двухкратная депротеинизация
фенол/ хлороформом , однократная
хлороформом. Центрифугирование
Осаждение ДНК спиртом, в
присутствии ацетата натрия в течение
1 часа при минус 20 0 С
Центрифугирование при 15600 g в
течение 15 мин при для температуре
4 0 С для отделения осадка
Двухкратное промывание осадка
ДНК 70 % спиртом, высушивание и
разведение в ТЕ буфере
Рисунок 11 – Схема выделения ДНК детергентно – ферментным методом.
Нами был опробован способ выделения ДНК методом горячего лизиса агаровой культуры пастерелл на водяной бане описанный в статье W. L. Araujo, D.A. de Angellis, J.L. Azevedo “Direct RAPD Evalution of Bacteria without Conventional DNA Extraction” [223]. Данный метод очень прост в исполнении: ДНК выделяется методом горячего лизиса - 50 мкл культуры инкубируется 10 минут на водяной бане, и хотя метод не дает высокую степень очистки экстрагированной ДНК (1,65-1,7), может использоваться при рутинной диагностической работе. Выход геномной ДНК при данном методе составлял 60-80 %. Таким образом, результаты качественного и количественного анализа показали, что наилучшим является метод с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.
2.3.2 Выделение геномной ДНК Pasteurella multocida из органно-тканевых материалов
Выделение ДНК из цельной крови проводили двумя методами: перхлоратным методом и методом щелочного лизиса. Отношение оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК Pasteurella multocida в обоих случаях имело средние значение 1,84 0,04 (рисунок 12).
Примечание - 1 – геномная ДНК Pasteurella multocida ; М – маркер ДНК "Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о.", Sigma. Рисунок 12 - Электрофореграмма препарата ДНК Pasteurella multocida перхлоратным методом и методом щелочного лизиса
Из полученных результатов видно, что в образцах на агарозном геле присутствуют полосы, соответствующие высокомолекулярной ДНК, а также отсутствуют следы деградации ДНК и низкомолекулярные фрагменты.
