В целях выделения ДНК из органов применяли метод Кавасаки. Была получена высокомолекулярна ДНК с отличной степенью очистки. Качество очистки препарата было дополнительно проанализировано по оптической экстинкции в ультрафиолетовом спектре при длине волны 260нм - 320 нм.
Таким образом, определены оптимальные методы выделения ДНК для дальнейшего проведения исследований по разработке метода ПЦР для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота.
2.4 Реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida
Рестрикционный анализ ДНК широко используется в молекулярно-биологических исследованиях и прикладных работах и является одним из наиболее важных инструментов при изучении ДНК. Большое разнообразие существующих эндонуклеаз рестрикции позволяет проводить расщепление ДНК по более 150 сайтам узнавания. Одним из важных элементов рестрикционного анализа является получение теоретически рассчитанной картины разделения фрагментов ДНК, определяемой на основе известной первичной структуры данной ДНК.
В наших экспериментах рестрикционный анализ проводили для определения молекулярной ДНК Pasteurella multocida. Молекулярный размер нуклеиновых кислот бактерий достаточно большой – более 2 миллионов пар оснований.
Очень важно, чтобы выделенная ДНК была нефрагментированной, так как в дальнейших экспериментах она будет служить матрицей для синтеза специфического продукта.
Целью данного этапа работы являлось подобрать оптимальную рестриктазу и условия рестрикции, провести анализ и обработку электрофореграмм. На конечном этапе работы предполагалось определить молекулярную массу геномной ДНК штамма Pasteurella multocida 90 и сравнить с данными литературы.
Первоначально были проведены эксперименты по выбору оптимальных ферментов рестрикции ДНК Pasteurella multocida и подбору оптимальных условий рестрикции. В экспериментах при выборе ферментов для расщепления ДНК Pasteurella multocida использовали рестриктазы Apa I, Ceu I, NotI. Характеристики рестриктаз представлены в таблице 7.
Таблица 7 - Характеристика использованных в работе рестрикционных эндонуклеаз
| Рестриктазы | Ионная сила | Сайты узнавания | Образование концов | Т инкубации, С |
|---|---|---|---|---|
| Apa I | Средн. | CAAGCTT | липкие | 37-55 |
| Ceu I | Высок. | (A/G)(A/G)A T(T/C)(T/C) | тупые | 37- 50 |
| NotI | Низкая | CGTACG | липкие | 37 -55 |
Реакционная смесь: в одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК Pasteurella multocida, 7 мкл H2O, 2 мкл 10х буфера (для каждой рестриктазы использовали соответствующий ей буфер, который прилагался к набору с рестриктазами фирмы "Sigma") и 1 мкл рестриктазы (10 ед/см3 ). В ходе опытов было опробовано несколько температурных режимов инкубации реакционной смеси. В результате экспериментов для расщепления ДНК оптимальной температурой инкубирования оказалось 370 С в течение 2 ч.
На рисунке 12 представлен результат опыта по рестрикции генома Pasteurella multocida штамм 90 различными эндонуклеазами.
Примечание - Ceul (1), ), Notl /Ceul (2), Notl (3), ApaI/ Ceul (4) и ApaI (5).справа М – маркер стандартных размеров ДНК в килобазах, слева М- маркер, ДНК фага , обработанная HindIII
Рисунок 13 - Электрофореграмма гидролизатов ДНК Pasteurella multocida, полученных с помощью обработки рестриктазами
В результате исследований нами определено среднее значение молекулярной массы геномной ДНК Pasteurella multocida. Молекулярная масса ДНК Pasteurella multocida при расщеплении Ceu l составила 2,345кб, Notl - 2,349 кб, а при обработке ApaI – 2,353кб. Среднее значение размера ДНК Pasteurella multocida составило 2,249 кб.
Как видно из фореграммы, при использовании всех трех рестриктаз получен хороший электрофоретический профиль. Молекулярная масса ДНК при расщеплении Apa I составила 2,353, при обработке Not I – 2,349, при обработке Ceul – 2,345кб. При расщеплении ДНК комплексом Notl /Ceul м олекулярная масса составила 2,359 кб, ApaI / Ceul – 2,360 кб. В 1998 году Meredith L. Hunt, Carmel G. Ruffolcu Kumar Rajakumar, Ben Abler [226] с целью физического и генетического картирования хромосомы Pasteurella multocida А:1 методом рестрикционного анализа генома определили молекулярную массу ДНК Pasteurella multocida равной 2,353кб.
В 2001 году May B. J., Zhang Q., Li L.L., Paustian M.L., Thomas S. [220] методом случайного секвенирования и компьютерного анализа определили, что геном штамма Pasteurella multocida Pm 70 - одинарная циркулярная хромосома - состоит из 2 257 487 пар оснований в длину. Таким образом, данные наших исследований относительно молекулярного размера ДНК Pasteurella multocida совпадают с литературными, особенно с размером ДНК штамма Pasteurella multocida А:1. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом.
Обработку полученных в экспериментах электрофореграмм проводили с помощью компьютерной программы "LabWorks 4.0". Для определения молекулярной массы геномной ДНК Pasteurella multocida определяли молекулярные массы рестриктов, их процентное содержание в пробе и сумму всех фрагментов рестрикции. В таблице 8 представлены молекулярные размеры фрагментов гидролиза ДНК штамма Pasteurella multocida 90.
