Полученные результаты представлены на рисунке 20.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
370
370 п.о.

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1-10 – буферные системы.

Рисунок 20 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК Pasteurella multocida в различных буферных системах и разных режимах

Из полученных результатов видно, что при использовании буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента. При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., представленный на рисунке яркими и четкими полосами. Существенных различий при использовании буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) не наблюдается. По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более высокой рН и использование данных концентраций MgCl2 и KCl приводит к ингибированию реакции.

Ферменту Taq-полимеразе при проведении ПЦР отводится основная роль. Концентрация фермента в реакции подбирается в зависимости от индивидуальной ДНК мишени или праймеров. Если концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется не достаточное количество амплификата. При подборе оптимальной концентрации брали активности фермента в реакционной смеси от 0,05 ед до 0,5 ед/50 мкл, и детектировали результаты амплификации гельэлектрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рисунке 21.

М 1 2 3 4 5 6
370п.о

Примечание - 1 – 0,05 ед; 2 – 0,1 ед; 3 – 0,2 ед; 4 – 0,3 ед; 5 – 0,4 ед; 6 – 0,5 ед; M –маркер "Direct Load^TM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о."

Рисунок 21 - Оптимизация концентрации Taq ДНК-полимеразы в реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР

Как видно из рисунка 21 концентрация Taq ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта: с повышением концентрации фермента в реакционной смеси интенсивность полос увеличивается, что свидетельствует о достаточной концентрации ДНК. При активности фермента всего 0,05 ед нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в разрабатываемой тест-системе полимераза является самым дорогим компонентом. Поэтому для разрабатываемой нами реакции мы выбрали наименьший расход фермента – 0,05 ед.

Специфичность и эффективность синтеза копий нуклеиновых кислот в ходе ПЦР зависят не только от качества и свойств ДНКполимеразы. Огромное значение придается и качеству других компонентов реакционной смеси. Mg²⁺ необходим для функционирования Taq - полимеразы. Чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона в рамках 0,5-2,5 мМ оптимальную концентрацию магния устанавливали путем титрования. Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM так как 10mM - ингибирует полимеразу на 40-50%. Увеличение концентрации Mg2+ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность ПЦР: увеличивается выход ПЦР продукта, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.

Результаты представлены на рисунке 22.420п.н. 2 3 4 5

В наших экспериментах мы изучили влияние концентрации хлорида магния, начиная с 1,5 мМ постепенно повышая концентрацию до предельного значения 4,0 мМ.

М 1 2 3 4 5 6
6666
370 п.н.

Примечание – 1- отрицательный контроль; 2 - 1,5 мМ; 3 – 2,0 мМ; 4 – 2,5 мМ; 5 – 3,0 мМ; 6 – 3,5; M- маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp"

Рисунок 22 - Оптимизация концентрации MgCl2 в реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР

Как видно из рисунка 22, изменение концентрации соли в пределах 1,5-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации. Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков. Нужно заметить, что и при концентрации MgCl2 2,5 мМ нарабатывалось достаточно большое количество специфического продукта. На основании полученных экспериментальных данных в дальнейших экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.

Дальнейшие исследования по оптимизации ПЦР проводили, используя различные, так называемые активаторы ПЦР. Соли хлорид калия в концентрации 10-50 мМ или сульфат аммония в концентрации 10-20 мМ добавляют для улучшения отжига праймера. В некоторых методиках рекомендуют использовать неионные детергенты Triton X100, Nonidet NP40 и Tween 20, 10 % в концентрации 0,05-0,1 %, буфер с сахарозой для стабилизации фермента. Однако роль денатурирующих агентов для нарушения вторичной структуры ДНК двояка: они могут не только способствовать полной денатурации матрицы, но и вызывать частичную инактивацию Taq-полимеразы и снижение выхода продукта