Использовали реакционную смесь следующего состава (300 мкл на 12 образцов):
Таблица 12- Состав реакционной смеси с праймерами omp 87, pfhB1, tadD
| Компонент | Объем на один образец | Объем на 12 образцов |
|---|---|---|
| KCl | 2,5 мкл | 30 мкл |
| dNTP | 0.5 мкл | 6 мкл |
| F праймер (omp87, pfh) | 0,5 мкл | 6 мкл |
| R праймер | 0,5 мкл | 6 мкл |
| Taq полимераза | 0,5 мкл | 6 мкл |
| MgCl2 | 1,0 мкл | 12 мкл |
| Деионизированная вода | 14,5 мкл | 174 мкл |
| ДНК | 5 мкл | 5 мкл |
Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 18.
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.)..
Из рисунка 18 видно, что при использовании праймера pfhB1 на дорожках 3и 4 образовались полосы, размером 165 п.н.
Для дальнейших исследований использовали праймеры на участок гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5-TGCGAGTATTACGCTACAAG-3 и Pm РfhB1 – R -5-TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3
При проведении ПЦР большое значение имеет фермент – полимераза, которая работает с комплексом элонгации (праймер и матрица ДНК). Элонгация – этап, на котором происходит основной синтез ДНК. На данный момент известно, что существует три класса
полимераз. Фермент выбирается в зависимости от размера специфического продукта. В наших исследованиях длина ПЦР-продукта составляет порядка 165 п.о. Рекомендуемой полимеразой при синтезе более 1000 п.о. является Taq-полимераза. Для работы Taq-полимеразы, в основном используют температуру 720 С, так как при этой температуре полимеразная активность максимальна. Однако температура 720 С приемлема не для всех случаев. При проведении эксперимента учитывали важный момент: если матрица взята в избытке, то полимераза будет "пренебрегать" неудобными участками для синтеза ДНК. В реальном процессе полимеразе необходимо пройти все имеющиеся в наличии участки.
Время синтеза определяется скоростью работы Taq-полимеразы и длиной амплифицируемого фрагмента. При расчётах учитывали, что для синтеза продукта размером 1000 п.о. необходима 1 минута, чтобы достроить вновь синтезированные комплементарные цепи ДНК. Введение же в конце дополнительного времени синтеза (10 мин) при 72 0С обеспечивает завершение синтеза всего имеющегося неполного амплификата.
В процессе исследований было изучено влияние продолжительности синтеза на наработку ПЦР продукта. Сокращение времени синтеза, позволяет сократить время постановки диагноза. Поэтому, при отработке параметров метода ПЦР большое значение было уделено экспериментальной оптимизации времени синтеза для амплификации продукта размером 165 п.о. Первоначально синтез проводили в течение 1 мин, далее уменьшали время на каждые 10 секунд. Результаты исследований представлены на рисунке 19.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 19 - Электрофореграмма продуктов ПЦР с использованием праймеров pfhB1 при различной продолжительности синтеза
М – маркер ДНК "50 bp DNA Ladder." BioLabs ", 1 – отрицательный контроль, 2 – 10 с. синтез, 3 – 15 с., 4 – 20 с., 5 - 25 с., 6 – 30 с., 7 – 40 с, 8 – 50 с, 9 – 60 с.
Из рисунка 19 видно, что при проведении синтеза в течение 10-15 секунд амплификаты отсутствуют. За 20 секунд нарабатывается ПЦРпродукт c очень низкой специфичностью. При проведении синтеза от 25 до 60 секунд в пробах нарабатывается достаточное количество ПЦРпродукта размером 165 п.о. Таким образом, полимераза полностью достраивает вновь синтезированные комплиментарные цепи ДНК за 30 секунд. В дальнейших экспериментах синтез ПЦР-продукта проводили в течение 30 секунд.
На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР:
пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 30 с, 950 С отжиг: 30 с, 570 С 30 циклов синтез: 30 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
2.5.2.2 Подбор оптимальных условий проведения ПЦР
Концентрация MgCl2, KCl и рН буфера в значительной степени определяют специфичность и чувствительность ПЦР. В случае изменения параметров буфера для ПЦР происходит качественное или количественное изменение получаемого амплификата.
Концентрация MgCl2 влияет на отжиг праймеров, денатурацию образца, кроме того, MgCl2 необходим для поддержания активности Taq-полимеразы. Однако, избыток хлорида магния может вызывать получение неспецифического амплификата.Трис-HCl и KСl обеспечивают необходимую ионную силу и рН смеси. Хлорид калия является активатором ПЦР и его добавляют для улучшения отжига праймеров. Предельной концентрацией KСl является 50 мМ, так как последующие увеличение может привести к ингибированию полимеразы [223].
Оптимизация концентраций MgCl2 , KСl и рН буфера может приводить к уменьшению выхода неспецифического продукта и увеличению выхода амплификата. Рабочие концентрации перечисленных выше соединений подбираются экспериментальным путем в процессе оптимизации условий реакции. Данную задачу значительно облегчают имеющиеся на сегодняшний день наборы для оптимизации ПЦР.
Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР был использован набор для оптимизации ПЦР – "PCR Optimization Kit II" фирмы "Sigma".
