2.5.2 Отработка и оптимизация параметров ПЦР

2.5.2.1 Подбор и отработка температурно-временного режима Очень важным и сложным этапом при разработке метода ПЦР является подбор и отработка параметров температуры и времени циклов амплификации.

Трем последовательным стадиям ПЦР: денатурации матрицы при нагревании, отжигу праймеров с одноцепочечной матрицей и синтезу второй цепи с помощью термостабильной ДНК-полимеразы соответствует определенный температурный профиль. Для каждой стадии экспериментальным путем подбирается температура и время. В общем случае температура этапа денатурации обычно выбирается между 90-95⁰ С, отжига между 40-60⁰ С, а элонгации между 70-75⁰ С. Кольцевая ДНК умеет денатурировать после тепловой денатурации. Поэтому температура и время денатурации выбираются как компромисс между двух целей: хорошо денатурировать матрицу, не сильно повредив при этом матрицу и Taq полимеразу, которые разрушаются при нагреве.

Температура, при которой денатурируется двуспиральная ДНКматрица, зависит от содержания в ней GC оснований. При высоком содержании GC оснований, для полного расхождения цепей в молекуле ДНК необходима более высокая температура. Так же более длинные матрицы ДНК требуют большей температуры для полной денатурации. Очень низкая температура денатурации, или короткая продолжительность времени денатурации приводят к тому, что участки ДНК с высоким содержанием GC оснований не расплетутся, а денатурируют только регионы богатые АТ-основаниями. Однако более продолжительное время денатурации или более высокая температура приводят к нежелательному снижению ферментативной активности полимеразы.

Эксперимент ПЦР проводили в двух температурных режимах.

В первом эксперименте использовали амплификатор Nexus,

используя следующие режимы температур: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 20 с, 94⁰ С отжиг: 20 с, 52⁰ С 30 циклов синтез: 20 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл на 12 образцов:

Таблица 10- Состав реакционной смеси с праймерами pfhB1 и tadD

Во втором эксперименте амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 20 с, 95⁰ С отжиг: 20 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 20 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл на 12 образцов:

Таблица 11 – Состав реакционной смеси с праймерами omp87, pfh

Для амплификации использовали все 3 пары праймеров: omp87, Pfh B1 b tadD. Результаты амплификации представлены в рисунке 17.

А - Программа, где для отжига праймеров использовали температуру- 52⁰ С.

Б - Программа, где для отжига праймеров использовали температуру - 57⁰ С.

М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.).

Из рисунка видно, что при отжиге праймеров при 52⁰ С не получены никакие сигналы амплификации. При температуре 57⁰ С произошел слабый отжиг праймеров PfhB1, вследствие чего нарабатывался незначительное количество ПЦР - продукта.

В следующем эксперименте попробовали увеличить температуры отжига. При температуре 58⁰ С выход продукта начинал резко снижаться, что обусловлено превышением значения критической температуры для данных пар праймеров. Поэтому, в дальнейших экспериментах использовали температуру отжига 57⁰ С.

При проведении следующего эксперимента учитывали важный момент: если ДНК взята в избытке, то при амплификации могут появиться неспецифические фрагменты продуктов амплификации. Поэтому, полученный нашими методами ДНК пастерелл разводили до 1000 раз. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме:

пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С