3'-tail GC %: 42,9 %
3'-tail dG: -10,1 kCal/mol
Molecular weight: 5554,6 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 5,01 µM and contains 27,8 µg ssDNA
Primer 2 self annealing:
5'-AGGCATGACTGTCACAAC-3'
: |||| :::: :
3'-CAACACTGTCAGTACGGA-5'
dG: -1,66 kcal/mol
5'-AGGCATGACTGTCACAAC-3'
||| :::
3'-CAACACTGTCAGTACGGA-5'
dG: -0,08 kcal/mol
Primer 2 loops:
5'-AGGCATGAC
: ||| T
3'-CAACACTG
dG: -0,20 kcal/mol
Primer 1 - Primer 2 annealing:
5'-AGCGAGCAACAGATAACG-3'
: |||| :
3'-CAACACTGTCAGTACGGA-5'
dG: -1,68 kcal/mol
Вывод программы из оригинала — последовательности и расчётные данные
Primer 1
Primer: 5ґ-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3ґ
Reverse: 3ґ-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5ґ
Length: 25 nt
Tm (basic): 62,0 0C
Tm (salt): 55,9 0C
Tm (NN): 59,8 0C
GC %: 24,0 %
dG: -43,5 kCal/mol
3'-tail GC %: 14,3 %
3'-tail dG: -11,2 kCal/mol
Molecular weight: 7774,1 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 3,37 µM and contains 26,2 µg ssDNA
Primer 1 self annealing:
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
||| : : :::
3'-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5'
dG: -0,68 kcal/mol
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
||| :: : : :: :::
3'-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5'
dG: -0,21 kcal/mol
Primer 1 loops:
5'-AATGAAATGAA
||| :: : A
3'-GTTTAAATTCGTC
dG: -0,09 kcal/mol
Primer 2
Primer: 5ґ-CGATAATAACGCATCGAGAAAATC-3ґ
Reverse: 3ґ-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5ґ
Length: 24 nt
Tm (basic): 66,0 0C
Tm (salt): 60,1 0C
Tm (NN): 63,0 0C
GC %: 37,5 %
dG: -44,4 kCal/mol
3'-tail GC %: 28,6 %
3'-tail dG: -10,5 kCal/mol
Molecular weight: 7424,9 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 3,52 µM and contains 26,1 µg ssDNA
Primer 2 self annealing:
5'-CGATAATAACGCATCGAGAAAATC-3'
||| : :: :: : :::
3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5'
dG: 0,16 kcal/mol
Primer 2 loops:
5'-CGATAATAACGC
||| : :: A
3'-CTAAAAGAGCT
dG: 0,28 kcal/mol
Primer 1 - Primer 2 annealing:
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
:: : |||
3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5'
dG: -0,21 kcal/mol
Таблица 9 - Подобранные праймеры для исследования
| Ген | Последовательность | Положение в геноме | Размер ампл.уч. п.н. |
|---|---|---|---|
| tadD | F 5`-TTCTACCCATTCTCAGCAAGGC-3` R 5`- ATCATTTCGGGCATTCACC-3` | 63-480 | 417 |
| omp87 | F 5`-AGCGAGCAACAGATAACG-3` R 5`-AGGCATGACTGTCACAAC-3` | 146-261 | 115 |
| pfhB1 | F 5`-TGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3` R 5`-GATAATAACGCATCGAGAAAAT-3` | 4926-5091 | 165 |
Для синтезирования праймеров была использована программа Clonemanager (http://www.scied.com/prcmpro. htm), с установкой на оптимальные параметры: температуру плавления Tmo= 58o -62o , длина 18-22 пар оснований (по), получаемый продукт 70-300 п.о. Допустимое количество праймеров-димеров – не более 4. Так же рассматривалось образование «шпильки», то есть отжиг с самим собой и повторные участки.
Помимо сходных температур плавления, по расчетным данным эти праймеры не должны образовывать стабильных гетеродуплексов друг с другом.
Фланкирующий праймерами участок ДНК был проверен с помощью программы BLAST (on-line free).
Результаты проверки показали, что нуклеотидная последовательность теоретически образуемого ПЦР-продукта соответствует Pasteurella multocida.
Смоделированные последовательности праймеров в дальнейшем были синтезированы на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems. Очистку праймеров проводили методом спиртового переосаждения. Полученные таким образом синтезированные праймеры разводили до концентрации 20 пмоль и использовали для проведения ПЦР.
