В наших экспериментах мы изучили влияние концентрации хлорида магния, начиная с 1,5 мМ постепенно повышая концентрацию до предельного значения 4,0 мМ.
М 1 2 3 4 5 6
6666
370 п.н.
Примечание – 1- отрицательный контроль; 2 - 1,5 мМ; 3 – 2,0 мМ; 4 – 2,5 мМ; 5 – 3,0 мМ; 6 – 3,5; M- маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp"
Рисунок 22 - Оптимизация концентрации MgCl2 в реакционной смеси при обнаружении ДНК Pasteurella multocida методом ПЦР
Как видно из рисунка 22, изменение концентрации соли в пределах 1,5-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации. Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков. Нужно заметить, что и при концентрации MgCl2 2,5 мМ нарабатывалось достаточно большое количество специфического продукта. На основании полученных экспериментальных данных в дальнейших экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.
Дальнейшие исследования по оптимизации ПЦР проводили, используя различные, так называемые активаторы ПЦР. Соли хлорид калия в концентрации 10-50 мМ или сульфат аммония в концентрации 10-20 мМ добавляют для улучшения отжига праймера. В некоторых методиках рекомендуют использовать неионные детергенты Triton X100, Nonidet NP40 и Tween 20, 10 % в концентрации 0,05-0,1 %, буфер с сахарозой для стабилизации фермента. Однако роль денатурирующих агентов для нарушения вторичной структуры ДНК двояка: они могут не только способствовать полной денатурации матрицы, но и вызывать частичную инактивацию Taq-полимеразы и снижение выхода продукта
амплификации. Формамид обычно используется для увеличения специфичности ГЦ богатых матриц. Глицерин – для стабилизации полимеразы и понижения температуры необходимой для разделения нитей, бетаин – оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов, температуры плавления различных матриц становятся более близкими). Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую температуру отжига праймеров. Нитевой связующий белок используется для стабилизации однонитевой ДНК, ускоряет процесс отжига комплиментарного праймера к ДНК-образцу. В наших экспериментах в качестве добавочных компонентов использовали сахарозу, тритон Х- 100, глицерин, бетаин и нитевой связующий белок. В качестве контроля в реакционную смесь вносили деионизированную воду. Результаты проведенных исследований представлены на рисунке 23.
М 1 2 3 4 5 6 М
370 п.н.
Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1 -бетаин , 2 - нитевой связующий белок , 3 - глицерин, 4 - тритон Х-100, 5 - сахароза, 6 - деионизированная вода (контроль). Рисунок 23 - Электрофореграмма амплифицированной ДНК Pasteurella multocida с различными добавками
На представленной электрофореграмме видно, что внесение добавочных компонентов (глицерина, тритона Х-100) в основной буфер приводит к ингибированию реакции. Незначительное положительное влияние на амплификацию специфического продукта оказало добавление 5% сахарозы, по видимому, за счёт стабилизации фермента, что видно при сравнении с контролем. Добавление бетаина и нитевого связующего белка существенного влияния на процесс амплификации не оказывает. Основываясь на вышеперечисленных результатах, мы не стали включать добавочные компоненты в рабочий буферный раствор.
Таким образом, результаты экспериментов по оптимизации концентрации компонентов реакционной смеси позволили использовать реакционную смесь следующего состава (50 мкл): х10 ПЦР буфер (100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP (10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,05 ед Taqполимеразы в конечной концентрации.
После того как были отработаны основные этапы метода ПЦР, мы определили время, которое затрачивается на стадии проведения реакции и детекцию. Для постановки диагноза достаточно 1ч 25 минут.
В последние время одной из основных тенденций развития метода ПЦР и его модификаций является сокращение времени проведения анализа. Данный факт очень важен при проведении исследований во время возникновения вспышек инфекции и в затруднительных ситуациях при постановке диагноза традиционными методами. Далее был проведен сравнительный анализ условий временного режима с аналогичными работами, представленными в литературе. В работе Miflin J.K., Blackall P.J. [196] на 1 цикл ПЦР затрачивается 3 минуты, что в 3 раза увеличивает время проведения исследований при сравнении температурно-временным режимом настоящей работы. Townsend K..M и др. [206] синтезировал специфический участок размером 372 п.о. при 720 С в течение 2 минут. Результаты наших исследований показывают, что для работы сконструированных нами специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта размером 372 п.о. для отжига и синтеза достаточно по 20 секунд, соответственно. При сопоставлении с работой Townsend K..M температурно-временной режим сокращается в 4 раза и тем самым значительно уменьшается общее время проведения исследований. При сравнении ПЦР условий, предложенными Афонюшкиным В.Н., [218], в отработанном нами методе на каждый цикл реакции требуется на 30 секунд меньше. Это позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida в более короткий срок.
Полученные нами результаты делают отработанный метод ПЦР наиболее эффективным, который позволяет увеличить скорость постановки диагноза.
2.5.3 Определение чувствительности ПЦР при диагностике пастереллеза
Одним из главных достоинств ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность.
После определения основных параметров разрабатываемого метода ПЦР для диагностики пастереллеза КРС, были проведены эксперименты по определению чувствительности данного метода. При изучении чувствительности ПЦР использовали разработанные оптимальные температурные и временные условия реакции. В наших
