экспериментах для выявления ДНК Pasteurella multocida использовали различные разведения ДНК штамма 90 Pasteurella multocida. Для проведения ПЦР делали 10-ти кратные разведения ДНК бактерии от 500 нг до 0,05 пг. Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 20.
В работе Nagai S, чувствительность метода ERIC -ПЦР для диагностики пастереллеза с использованием праймеров на участок toxA гена достигала всего 25 пг [166]. Порог чувствительности метода геномных «отпечатков пальцев» ПЦР в работах индийских ученых составил 1-10 фг [173,176].Чувствитеьность метода геномных «отпечатков пальцев» на порядок выше. Метод ПЦР разработанный Saxena MK, et al.при диагностике пастереллеза позволяет выявлять ДНК пастерелл в количестве 500 нг-50 фг в пробе [164].
Таким образом, по литературным данным, порог чувствительности различных модификаций метода ПЦР для выявления ДНК Pasteurella multocida варьирует в пределах 50 пг-50 фг.
370 п.н.
Примечание - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida в концентрациях: 1 – 500 нг; 2 – 50 нг; 3 – 5 нг; 4 – 500 пг; 5 – 50 пг; 6 – 5 пг; 7 – 0,5 пг; 8 –0,05 пг. М – маркер ДНК “Direct LoadTM Wide Range DNA Marker, 50 – 10000 bp”.
Рисунок 24 - Определение чувствительности ПЦР при выявлении ДНК Pasteurella multocida
Как видно из рисунка 24 чувствительность метода ПЦР составила 37 0,5 пг ДНК Pasteurella multocida в пробе. Результаты экспериментов 370 п.н.
показали, что отработанный метод ПЦР обладает высокой чувствительностью.
Результаты наших исследований по определению чувствительности не уступают аналогичным работам зарубежных ученых. Значение порога чувствительности 0,5 пг в пробе и сокращение времени проведения диагноза повышают диагностическую ценность отработанного метода.
2.5.4 Определение специфичности ПЦР при пастереллезе КРС Чувствительность и специфичность - основные достоинства, определяющие преимущество метода ПЦР по сравнению с традиционными методами. Специфичность метода ПЦР основана на уникальности ДНК, поэтому многократно превосходит другие методы диагностики, в том числе ИФА.
Дальнейшие исследования проводили по определению специфичности разработанной нами и оптимизированной ПЦР. В работе Chang P.C и Lee Y. специфичность ПЦР проверяли, используя ДНКобразцы, выделенные из Haemophilus influenzae и Escherichia coli, В. pertussis. Ни в одном из образцов не нарабатывались специфические продукты, что доказывало высокую специфичность метода. В своей работе Townsend K.M специфичность метода проверял, используя бактериальные инфекции, симптомы которых очень похожи между собой, и другими методами эти инфекции дифференцировать очень трудно [189]. В экспериментах использовали ДНК штамма Pasteurella multocida 90.
ПЦР-продукт размером 372 п.о. нарабатывался только в пробах, содержащих ДНК Pasteurella multocida.
Для определения специфичности ПЦР в наших экспериментах использовали штаммы Escherichia coli, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Listeria monocitogenes, Brucella abortus, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Lysteria monocytogenes
В качестве положительного контроля при постановке ПЦР использовали ДНК Pasteurella multocida штамм 90, в качестве отрицательного контроля использовали деионизированную воду. Результаты исследований представлены на рисунке 25.
370 п.н.
М – маркер «Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о.», 1- контроль (Н2О), 2,3 - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida, 4 - ДНК Escherichia coli ; 5 - ДНК Salmonella typhimurium; 6,7 – ДНК Pasteurella multocida штамм К1 и К2; 8,9 - ДНК Pasteurella multocida из органо-тканевого материала, 10 - ДНК Salmonella Dublin, 11 - Brucella abortus, 12 - Mycobacterium bovis, 13 – ДНК Listeria monocitogenes. Рисунок 25 - Электрофореграмма продуктов амплификации при использовании праймеров Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R
Как видно из рисунка 25 только в пробах, содержащих ДНК Pasteurella multocida нарабатываются специфические продукты реакции размером около 372 п.о. (2-4, 9, 11-14). Отрицательные результаты были получены при использовании в качестве матриц ДНК Escherichia coli (4), Salmonella typhimurium (5), Listeria monocitogenes (13), Mycobacterium bovis (12), а также при использовании в качестве матриц ДНК Salmonella Dublin, Brucella abortus. Отсутствие каких-либо продуктов амплификации наблюдается и с деионизированной водой (1). Полученные результаты демонстрируют специфичность разработанного нами метода.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР.
2.6 ПЦР тест-система для выявления ДНК
На основании результатов разработанного метода ПЦР был составлен опытный образец тест-системы для выявления пастереллеза КРС в биологическом материале, с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. Состав основных компонентов набора, необходимых для постановки реакции ПЦР: буфер для проведения реакции, специфические олигонуклеотиды (праймеры),
