Таблица 7 - Характеристика использованных в работе рестрикционных эндонуклеаз

Реакционная смесь: в одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК Pasteurella multocida, 7 мкл H2O, 2 мкл 10х буфера (для каждой рестриктазы использовали соответствующий ей буфер, который прилагался к набору с рестриктазами фирмы "Sigma") и 1 мкл рестриктазы (10 ед/см³ ). В ходе опытов было опробовано несколько температурных режимов инкубации реакционной смеси. В результате экспериментов для расщепления ДНК оптимальной температурой инкубирования оказалось 37⁰ С в течение 2 ч.

На рисунке 12 представлен результат опыта по рестрикции генома Pasteurella multocida штамм 90 различными эндонуклеазами.

Примечание - Ceul (1), ), Notl /Ceul (2), Notl (3), ApaI/ Ceul (4) и ApaI (5).справа М – маркер стандартных размеров ДНК в килобазах, слева М- маркер, ДНК фага  , обработанная HindIII

Рисунок 13 - Электрофореграмма гидролизатов ДНК Pasteurella multocida, полученных с помощью обработки рестриктазами

В результате исследований нами определено среднее значение молекулярной массы геномной ДНК Pasteurella multocida. Молекулярная масса ДНК Pasteurella multocida при расщеплении Ceu l составила 2,345кб, Notl - 2,349 кб, а при обработке ApaI – 2,353кб. Среднее значение размера ДНК Pasteurella multocida составило 2,249 кб.

Как видно из фореграммы, при использовании всех трех рестриктаз получен хороший электрофоретический профиль. Молекулярная масса ДНК при расщеплении Apa I составила 2,353, при обработке Not I – 2,349, при обработке Ceul – 2,345кб. При расщеплении ДНК комплексом Notl /Ceul м олекулярная масса составила 2,359 кб, ApaI / Ceul – 2,360 кб. В 1998 году Meredith L. Hunt, Carmel G. Ruffolcu Kumar Rajakumar, Ben Abler [226] с целью физического и генетического картирования хромосомы Pasteurella multocida А:1 методом рестрикционного анализа генома определили молекулярную массу ДНК Pasteurella multocida равной 2,353кб.

В 2001 году May B. J., Zhang Q., Li L.L., Paustian M.L., Thomas S. [220] методом случайного секвенирования и компьютерного анализа определили, что геном штамма Pasteurella multocida Pm 70 - одинарная циркулярная хромосома - состоит из 2 257 487 пар оснований в длину. Таким образом, данные наших исследований относительно молекулярного размера ДНК Pasteurella multocida совпадают с литературными, особенно с размером ДНК штамма Pasteurella multocida А:1. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом.

Обработку полученных в экспериментах электрофореграмм проводили с помощью компьютерной программы "LabWorks 4.0". Для определения молекулярной массы геномной ДНК Pasteurella multocida определяли молекулярные массы рестриктов, их процентное содержание в пробе и сумму всех фрагментов рестрикции. В таблице 8 представлены молекулярные размеры фрагментов гидролиза ДНК штамма Pasteurella multocida 90.

Таблица 8 - Молекулярные размеры (п.о.) фрагментов гидролиза ДНК Pasteurella multocida

Из таблицы видно, что в результате исследований нами определено среднее значение молекулярной массы геномной ДНК штамма Pasteurella multocida 90 – 2,353  8 (n=5) п.о

Таким образом, показано, что данные относительно молекулярного размера ДНК Pasteurella multocida совпадают с литературными, особенно с размером ДНК Pasteurella multocida А:1. Установлено, что используемый нами метод экстрагирования ДНК позволяет получать полноразмерную и нефрагментированную нуклеиновую кислоту. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом.

2.5 Разработка и оптимизация метода ПЦР для диагностики Pasteurella multocida

Полимеразная цепная реакция, ПЦР не сходит с заголовков статей научных журналов с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он был удостоен Нобелевской премии.

Появление метода ПЦР было обусловлено определенными достижениями молекулярной генетики, прежде всего расшифровкой нуклеотидной последовательности геномов ряда микроорганизмов. Простота исполнения и непревзойденные показатели