перемешивают. 2,5 % суспензию эритроцитов можно хранить в течение 4-5 дней при температуре +4°C.
Реакция гемолиза проводится по A.Neimann-Sorensen (1957) в модификации F.Zur (1977): в лунки пластмассовых блоков из специального оргстекла вносят 2 капли соответствующей сыворотки, одну каплю 2,5 % суспензии эритроцитов и одну каплю комплемента. Смесь встряхивают и помещают в термостат при температуре +30+2°C. Читка реакции проводится трижды: через 30 мин, 2 и 4 часа с момента внесения комплемента. Степень гемолиза определяют по бальной системе:
-
4 балла — все эритроциты гемолизированы, жидкость рав-
-
номерно окрашена, прозрачна;
-
3 балла — на дне видны единичные эритроциты, образует-
-
ся легкое помутнение при взбалтывании;
-
2 балла —1/2 часть эритроцитов на дне лунки, жидкость
-
над осадком умеренно окрашена;
1 балл — около 3/4 частей эритроцитов на дне лунки, жидкость над осадком слабо красного цвета;
-
- все эритроциты на дне лунки, над осадком жидкость слегка красная, следы гемолиза заметны в виде ободка над осевшими эритроцитами;
О — все эритроциты целые, надосадочная жидкость прозрачная.
Комплемент является основной частью в реакции гемолиза. В качестве комплемента используется натуральная кроличья сыворотка с добавлением лиофилизированной сыворотки морской свинки в соотношении 25:4. Комплемент получают из крови кроликов при забое. Кровь инкубируют при температуре +30° С в термостате в течение двух часов. От образовавшегося сгустка сыворотку отделяют центрифугированием.
В сыворотке кролика нередко встречаются натуральные антитела против эритроцитарных антигенов овец, поэтому на их наличие необходимо исследовать каждую партию комплемента гемолитическим тестом. При выявлении натуральных антител сыворотку кролика абсорбируют в соотношении 4:1 смесью эритроцитов овец дважды по 10 мин. Хранится комплемент при минус 18°C продолжительное время.
При отсутствии кроличьего комплемента можно использовать сыворотку морской свинки. Для этого кровь берут непосредственно из сердца от нескольких животных в один флакон. Сыворотка в нативном виде хранится в холодильнике при температуре -18-20° C. Перед постановкой реакции сыворотку разводят изотоническим раствором в отношении 1:20. Срок хранения такой же, как кроличьего комплемента. Сухой комплемент морской свинки непригоден для определения эритроцитарных антигенов у овец.
Реакция агглютинации. Две капли соответствующей сыворотки и одну — 2,5 % суспензии эритроцитов вносят в лунки блоков, и после встряхивания, смесь помещают в термостат при t +30+2° С. Учет результатов реакции проводят 2 раза — через 30 мин. и 2 часа с момента постановки реакции. Степень агглютинации определяется следующим образом:
-
- наличие реакции, в лунке образуется хорошо видимые конгломераты склеенных эритроцитов; + - наличие небольшого количества малых конгломератов склеенных эритроцитов на две лунки;
-
- отсутствие реакции.
После завершения цикла иммунизаций, у реципиентов берут большой объем (до 1 литра) крови в емкости из пластмассы. Полученную (без консерванта ) кровь выдерживают в течении 1-2 часов при комнатной температуре, разрезают об-
разовавшийся сгусток профламбированным металлическим стержнем и оставляют при комнатной температуре на сутки. За это время сыворотка отделяется от кровяного сгустка. Ее сливают, центрифугируют в течение 10 минуг при 3000 об/мин., инактивируют в водяной бане при температуре +56°C в течение 30 минуг (для разрушения комплемента). После инактивации сыворотку разливают в стеклянные или полиэтиленовые сосуды и ставят на хранение при температуре -18-20° C. Сыворотку для анализа наливают в несколько сосудов малой емкости (10-20 мл). На этикетке каждого сосуда пишут номера реципиента и донора (лабораторные и ушные), дату последней иммунизации или реиммунизации, а также номер абсорбента. Если сыворотка содержит одно антитело, то его обозначение пишут сверху этикетки.
Данные о количестве полученной поливалентной сыворотки записывают в карточку хранения «сырой» сыворотки и ведут учет по мере ее расходования.
Состав антител «сырых» сывороток выявляется методом разведения. Используя при этом стандартные разведения 1:2 — 1:4. Для исключения неспецифических реакций при их постановке необходимы свежеполученные эритроциты. Ставят два контроля: один — на качество эритроцитов, другой — на качество комплемента. Контроль эритроцитов: три капли изотонического раствора плюс одна капля 2,5% суспензии эритроцитов. Контроль комплемента: две капли изотонического раствора плюс одна капля 2,5 % суспензии эритроцитов, плюс одна капля комплемента. Контроль обязателен также и для реакции агглютинации, где вместо двух капель сыворотки берется две капли изотонического раствора. Контроль ставится против эритроцитов каждой исследуемой овцы.
