При расчете необходимого количества крови для реакций исходят из того, что | мл равен 20 каплям (то есть одна капля соответствует объему 0,02 мл). Иммунологические блоки должны быть совершенно чистыми и сухими. Их предварительно тщательно моют и высушивают при температуре не выше +60° С. Результаты реакции регистрируют в специальных ведомостях, причем оценку при первом чтении реакции обозначают синей, при втором — зеленой, при третьем — красной пастой.
При проведении реакций гемолиза и агглютинации, зачастую, не только устанавливают наличие или отсутствие гемолиза или агглютинации, но и определяют титр антител, то есть наибольшую степень разбавления сыворотки изотоническим раствором, при которой происходит гемолиз. В каждую лунку, кроме первой, вносят по две капли изотонического раствора, а в первую и вторую лунки - по две капли специфической сыворотки. Затем из второй лунки отбирают две капли смеси (предварительно встряхнув блок) и переносят в третью и т. д. Таким образом устанавливают окончательный и рабочий титр исследуемой «сырой» сыворотки.
Основным и наиболее точным методом определения состава «сырых» сывороток, а также чистоты реагентов является анализ путем абсорбции. Если полученная сыворотка реагирует с конкретными эритроцитами панели, то следует провести последовательную абсорбцию этими эритроцитами. После каждой абсорбции при конфронтации сыворотки с прежней панелью могут быть две ситуации. Первая — сыворотка после абсорбции не реагирует с теми сыворотками, с которыми она реагировала до абсорбции. Это означает, что сыворотка является моноспецифическим реагентом. Вторая — после абсорбции сыворотка не реагирует только с эритроциTaMH, которыми она абсорбирована, а с остальными - реаги-
рует. Это означает, что сыворотка имеет сложный поливалентный состав и необходимо продолжить ее абсорбцию со всеми реагирующими с ней эритроцитами. Титр и характер антител в «сырой» сыворотке определяет количество необходимых абсорбций- 3-4, иногда и больше. В зависимости от числа предполагаемых абсорбций данной сыворотки берут соответственно 4 или 3 центрифужные пробирки. Их маркируют, заполняют осторожно размешенной консервированной кровью. Затем кровь отделяют от консерванта центрифугированием и 3 раза отмывают изотоническим раствором. К отмытым эритроцитам в первую пробирку наливают сыворотку, которую намечено абсорбировать данными эритроцитами. Отношение количества сыворотки к эритроцитам 1:1 или 2:3.
При анализирующей абсорбции 2-3 мл сыворотки предварительно разбавляют в отношении 1:1-8, в зависимости от титра. Абсорбцию после тщательного перемешивания смеси сыворотки с эритроцитами проводят при комнатной температуре в течение 45 мин в зависимости от сложности сыворотки. Во время инкубации содержимое пробирки 2-3 раза перемешивают, центрифугируют (5-10 мин) при 3-5 тыс. об/мин, сыворотку отделяют и переносят для следующей абсорбции во вторую пробирку с заранее приготовленными эритроцитами. Вторую абсорбцию проводят также в течение 45 мин при комнатной температуре, центрифугируют, переносят сыворотку в третью пробирку с подготовленными эритроцитами для третьей абсорбции. После последней абсорбции при комнатной температуре проводят заключительную — при +4° С, помещая пробирку со смесью эритроцитов и сыворотки на 30 мин в холодильник. Абсорбция при низких температурах удаляет холодовые и некоторые тепловые антитела.
Вслед за анализирующей абсорбцией сыворотку подвергают конфронтации с панелью эритроцитов известных по антигенным свойствам. Для контроля чистоты абсорбции в панель включают эритроциты, которыми проводили абсорбцию, а также эритроциты животного, от которого взята сыворотка.
На основании конфронтации делается анализ состава сыворотки. В случае, если анализирующая абсорбция всеми, без исключения, реагирующими эритроцитами приводит к полному удалению антител, то можно сделать заключение, что данная сыворотка моноспецифична. Если же конфронтация после первых абсорбций указывает на сложность поливалентных сывороток, то продолжают абсорбции по вышеизложенной схеме до расщепления сыворотки на моноспецифические реагенты.
Принцип абсорбции заключается в том, что одноименные антигены и антитела взаимодействуют друг с другом и тем самым «истощают» сыворотку от соответствующих антител. В эритроцитах не должно быть антигенов, против которых изготовляется антисыворотка.
Кроме того, необходимо подобрать такой спектр эритроцитов, с помощью которых можно было бы добиться максимального удаления нежелательных антител, так как многократные абсорбции усложняют работу и ухудшают качество изготовляемой сыворотки. Нами установлено, что для получения хорошего качества моноспецифической сыворотки достаточно крови от 3-4 животных и трех последовательных абсорбций.
Техника абсорбции для получения моноспецифических сывороток в больших количествах, для пополнения банка реагентов, почти не отличается от техники абсорбции для анализа сыворотки. Подготовленные эритроциты разделяют
