рует. Это означает, что сыворотка имеет сложный поливалентный состав и необходимо продолжить ее абсорбцию со всеми реагирующими с ней эритроцитами. Титр и характер антител в «сырой» сыворотке определяет количество необходимых абсорбций- 3-4, иногда и больше. В зависимости от числа предполагаемых абсорбций данной сыворотки берут соответственно 4 или 3 центрифужные пробирки. Их маркируют, заполняют осторожно размешенной консервированной кровью. Затем кровь отделяют от консерванта центрифугированием и 3 раза отмывают изотоническим раствором. К отмытым эритроцитам в первую пробирку наливают сыворотку, которую намечено абсорбировать данными эритроцитами. Отношение количества сыворотки к эритроцитам 1:1 или 2:3.
При анализирующей абсорбции 2-3 мл сыворотки предварительно разбавляют в отношении 1:1-8, в зависимости от титра. Абсорбцию после тщательного перемешивания смеси сыворотки с эритроцитами проводят при комнатной температуре в течение 45 мин в зависимости от сложности сыворотки. Во время инкубации содержимое пробирки 2-3 раза перемешивают, центрифугируют (5-10 мин) при 3-5 тыс. об/мин, сыворотку отделяют и переносят для следующей абсорбции во вторую пробирку с заранее приготовленными эритроцитами. Вторую абсорбцию проводят также в течение 45 мин при комнатной температуре, центрифугируют, переносят сыворотку в третью пробирку с подготовленными эритроцитами для третьей абсорбции. После последней абсорбции при комнатной температуре проводят заключительную — при +4° С, помещая пробирку со смесью эритроцитов и сыворотки на 30 мин в холодильник. Абсорбция при низких температурах удаляет холодовые и некоторые тепловые антитела.
Вслед за анализирующей абсорбцией сыворотку подвергают конфронтации с панелью эритроцитов известных по антигенным свойствам. Для контроля чистоты абсорбции в панель включают эритроциты, которыми проводили абсорбцию, а также эритроциты животного, от которого взята сыворотка.
На основании конфронтации делается анализ состава сыворотки. В случае, если анализирующая абсорбция всеми, без исключения, реагирующими эритроцитами приводит к полному удалению антител, то можно сделать заключение, что данная сыворотка моноспецифична. Если же конфронтация после первых абсорбций указывает на сложность поливалентных сывороток, то продолжают абсорбции по вышеизложенной схеме до расщепления сыворотки на моноспецифические реагенты.
Принцип абсорбции заключается в том, что одноименные антигены и антитела взаимодействуют друг с другом и тем самым «истощают» сыворотку от соответствующих антител. В эритроцитах не должно быть антигенов, против которых изготовляется антисыворотка.
Кроме того, необходимо подобрать такой спектр эритроцитов, с помощью которых можно было бы добиться максимального удаления нежелательных антител, так как многократные абсорбции усложняют работу и ухудшают качество изготовляемой сыворотки. Нами установлено, что для получения хорошего качества моноспецифической сыворотки достаточно крови от 3-4 животных и трех последовательных абсорбций.
Техника абсорбции для получения моноспецифических сывороток в больших количествах, для пополнения банка реагентов, почти не отличается от техники абсорбции для анализа сыворотки. Подготовленные эритроциты разделяют
на 3 или 4 равные по объему части (в зависимости от количества абсорбций). Одну часть смешивают с равным или лучше несколько меньшим количеством сыворотки и оставляют на 45 минут при комнатной температуре, через каждые 10 мин осторожно перемешивая смесь, затем центрифугируют ее до полного отделения от эритроцитов. Смешивают с сывороткой вторую порцию подготовленных эритроцитов и проводят второй этап абсорбции, затем заключительный, который отличается только тем, что после инкубации сыворотку переносят на 30 мин в холодильник для абсорбции при +4°C.
Если «сырую» сыворотку абсорбируют смесью эритроцитов двух животных (для одновременного удаления нескольких антител), то необходимо брать эритроциты от каждого животного в отношении к объему сыворотки не менее 1:1. Полученный реагент тщательно проверяют на чистоту путем контрольной конфронтации с большой панелью — 80-100 животных, с хорошо известным антигенным составом эритроцитов. Полученные результаты должны подтвердить специфичность антисыворотки в отношении к определенному кровяному фактору. Только таким образом проверенную антисыворотку готовят в большом объеме, включают в набор антисывороток и используют для определения групп крови.
Рабочий титр реагентов должен быть не ниже 1:4, каждый реагент проверяется на специфичность по параллельным реакциям с ранее испытанными эталонными образцами, прошедшими международные, региональные сверки. Периодически (1 раз в 2 года) иммуноспецифичность всего набора реагентов должна подтверждаться сверками различного уровня.
На флаконы с изготовленными сыворотками наклеиваются этикетки, с указанием места изготовления реагента, его
