(50 мкл): х10 ПЦР буфер (100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP (10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,05 ед Taq-полимеразы в конечной концентрации.

Результаты по подбору и оптимизации температурновременного режима показали, что в пределах температур от 52,5 до 59,5 0С специфический ПЦР-продукт нарабатывается в достаточных количествах, отсутствуют шлейфы. Полимеразе для наработки ПЦРпродукта размером 372 п.о. в нашем случае достаточно 20 с. Обобщая все температурно-временные характеристики, при проведении ПЦР использовали следующие условия: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С

пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использование данного режима существенно сокращает время постановки диагноза при сравнении температурно-временных профилей, приводимых в литературе. Данное обстоятельство повышает диагностическую ценность разработанного метода по обнаружению ДНК Pasteurella multocida.

5 Проведенные эксперименты по определению специфичности метода ПЦР с праймерами Рm 16SRNA- F , Рm 16SRNA- R показали образование ПЦР продукта, характерного только для Pasteurella multocida. Разработанный метод позволяет выявлять ДНК бактерий в концентрации 0,5 пг в исследуемой пробе. Порог чувствительности метода ПЦР с различными модификациями по обнаружению ДНК Pasteurella multocida по данным литературы изменяется в пределах 50 пг–50 фг . Результаты наших исследований по чувствительности не уступают зарубежным аналогичным работам.

6 Разработанный лабораторный вариант тест-системы для обнаружения ДНК Pasteurella multocida был апробирован на штаммах Pasteurella multocida, хранящихся в музее микроорганизмов лаборатории противобактериозной биотехнологии; биологических (кровь, смывы из ротовой и носовой полостей) патологических материалах от павших животных, доставленных из хозяйств. Нарабатывался специфический продукт только в тех пробах, которые содержали ДНК Pasteurella multocida. Разработанная ПЦР тест-система для обнаружения ДНК Pasteurella multocida в пробах органов павших и больных животных может быть использована для диагностики болезни.

Список использованной литературы

1 Watt J.M., Swiatlo E., Wade M.M., Champlin F.R. Regulation of capsule biosynthesis in serotype A strains of Pasteurella multocida// Microbiol Lett. -2003.- V. 8. – Р. 9-14.

2 Ewers C., Lübke-Becker A., Bethe A., Kiebling S., Filter M., Wieler L.H. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status//Vet Microbiol. –2006. - v.7. - Р. 3- 4.

3 Шегидевич Э.А., Федотов В.Б., Крючков В.Я. Серотиповой состав Пастерелла мультоцида // Труды ВИЭВ. – М., 1983. – Т. 38. – С.15-19.

4 Масимов К.А. Значение пастерелл (Р.multocida) при остром респираторном синдроме парагриппа-3 у телят в откормочных хозяйствах промышленного типа: автореф. ...канд.дисс. – М., 1982. – 29 с.

5 Gautam R., Kumar A.A., Singh V.P., Singh V.P., Dutta T.K., Shivachandra SB. Specific identification of Pasteurella multocida serogroup-A isolates by PCR assay// Res Vet Sci.- 2004. - v.3. –Р.179-85.

6 Масимов Н.А. Пастереллез животных: Лекция // Моск. Гос. Акад. вет. медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябина. – М., 1995. – 12с.

7 Сосов Р.Ф. Пастереллез // Эпизоотология. - М.:Колос, 1974. - С.4-5.

8 Rapports. de L^| Office Inretnational des Episooties Sessin generale de mai,1979,С. 12-14.

9 Джупина С.И., Колосов А.А. Особенности эпизоотологии, клинического проявления и диагностики пастереллеза в Новосибирской области // Профилактики и лечение болезней крупного рогатого скота. - 1992. - № 24. - С.15-22.

10 Салимов В.А., Жаров А.В. // Ветеринария. - 2007.-№ 6. – С. 14 - 15.

11 Намет А.М. Иммунопрофилактика пастереллеза лошадей: автореф. докт. вет. наук. –Алматы, 2006. –3 с.

12 Кожаев А.Н. Поливалентная вакцина против пастереллеза сельскохозяйственных животных: автореф. … канд. вет. наук. –Алматы, 2008. –3 с.

13 Борисенкова А.Н. Рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с пастереллезом птиц: технологические процессы // Госагропром СССР. ВНИВИП. - Л., 1986. - 25 с.

14 Пустовит Г.Л., Федотов Н.И., Кучеренко Л.А. Некоторые особенности эпизоотологии и течения пастереллеза свиней // В кн.: Инфекционные и инвазионные болезни с.-х. животных и птиц. – Одесса, 1983. – С.15-18.

15 Луницын В.Г. Пастереллоносительство у пантовых оленей, некоторых видов грызунов и птиц в Горном Алтае // НИИ пушного звероводства и кролиководства. – 1984. – Т. 30. – С.160-168.

16 Чоенбаев З.Н., Сарымсаков Е.С. О заболеваемости лошадей пастереллезом // Профилактика и меры борьбы с инфекционными и незаразными болезнями с.-х. животных в Казахстане. – Алма-Ата, 1984. – С.137-140.

• 17 Коломакин Г.А. Пастереллез жеребят // Ветеринария. - 1960. -

• № 7. - 45 с.

• 18 Зеленский В.П. Пастереллез свиней: автореф. ...докт. дисс. –

• Омск, 1965. – 39 с.

19 Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота: автореф. ...докт.вет.наук. – М., 1993.

• 20 Велиев Ш.В. Эпизоотология пастереллеза овец // Тез. докл. III

• Всесоюзн. конф. по эпизоотологии. – Новосибирск, 1991. – С.322-323. 21 Стаценко Н.И. Случай пастереллеза сайгаков в

• Кургальджинском заповеднике // Вестник с.-х. науки Казахстана. – 1980. - № 5. – С.66-67.

• 22 Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллеза птиц. – Москва,

• 1. – 87 с.

• 23 Цимох П.Ф., Сердюк Н.Г., Бакай А.Ф. Пастереллез птиц //

• Ветеринария.- 1967. - № 5. – С. 111.

• 24 Ganiere J.P., Franccise E. Characterization of Pasteurella multocida

• from gingival scraping of dogs and cats // Comp.Imm.Microbiol. & Inf.Dis. – 1992. – V. 16. - № 1. – P. 21-22, 77-85.

• 25 Aldova E., Frederiksen W. Aerogenic pasteurellas and Pasteurella –

• like organisms isolated in Czechoslovakia // Zentralblatt fur Bacteriologie. – 1992. – V. 277. - № 1. – P.139.

• 26 Лундаа Ц . Эпизоотология пастереллеза крупного рогатого

• скота, овец и его специфическая профилактика в МНР: автореф. ...канд.вет.наук. – Улан-Батор,1989. – 22 с.

• 27 Курченко Ф.П., Гононов Ю.М., Уфимцев К.П. К вопросу об

• инфекционной патологии сайгаков // Тез. докл. I Всесоюзн. конфер. «Проблемы патологии и экологической взаимосвязи болезней диких теплокровных и с.-х. животных». – М., 1988. – С.45-46.

• 28 Буткин Е.М. Пастереллез птиц. – М., 1972. – 100 с. 29 Никифорова Н.М., Лукьянченко А.В. Пастереллезы //

• Ветеринарные препараты. – М., 1981. – С.236-251.

30 Занина В.М., Занин Л.Ф., Латышева Л.В. К характеристике пастереллеза у диких грызунов Северного Дагестана // Особо опасные инфекции на Кавказе. - Ставрополь, 1970 - Вып. 2. - С.147-150.