эпизоотические штаммы пастерелл обладают вирулентными и антигенными свойствами.

Результаты качественного и количественного анализа препаратов ДНК показали, что наилучшим является метод с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.

По результатам рестрикционного анализа среднее значение размера ДНК штамма 90 Pasteurella multocida составило 2.353 kb. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом.

В наших экспериментах для дизайна праймеров была использована последовательность гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5TGCGAGTATTACGCTACAAG-3 и Pm РfhB1 – R -5TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3 Pasteurella multocida.

Были сконструированы и синтезированы специфические праймеры на участки генов pfhB1.

Были определены временные и температурные условия амплификации, проводили оптимизацию содержания компонентов в реакционной смеси и отработку ПЦР.

На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Были отработаны оптимальные условия проведения ПЦР по составу солевого буфера ( концентрация MgCl2 и KCl, рН буфера), оптимизирована концентрация Taq ДНК-полимеразы, добавочных компонентов буфера.

Порог чувствительности метода ПЦР с различными модификациями для выявления ДНК Pasteurella multocida составил 0,5 пг в пробе и сокращение времени постановки диагноза (20 сек.) - повышают диагностическую ценность отработанного метода. Полученные нами данные показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР. Результаты испытаний показали, что разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных штаммов, также и из патологических материалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Своевременная и точная диагностика инфекции является одним из основных факторов в недопущении ее распространения, что позволяет предотвращать и существенно снижать экономические потери. Для лабораторной диагностики и идентификации пастереллеза на сегодняшний день разработаны и применяются различные культуральные, серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность. В связи с молниеносным течением инфекции вопросы прижизненной диагностики пастереллеза до настоящего времени остаются нерешенными. Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики, остается актуальной проблемой и до настоящего времени

В контексте поставленных задач полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет многократного копирования участков специфических последовательностей ДНК. Прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа сделали метод ПЦР незамениным. В связи с этим, нами были проведены исследования по разработке метода ПЦР для детекции ДНК Pasteurella multocida, а так же изучена эффективность разработанного метода для диагностики болезни.

1 Для разработки ПЦР необходимо наличие нативных и высокоочищенных полноразмерных нефрагментированных препаратов геномной ДНК Pasteurella multocida во избежание получения недостоверных результатов. Поэтому необходимо было отработать схему выделения, позволяющую получить высокоочищенные препараты ДНК. В экспериментах по выделению ДНК Pasteurella multocida использовали выделенные эпизоотические штаммы и музейные штаммы Pasteurella multocida. Существует множество методов для выделения нуклеиновой кислоты бактерий. Нами для выделения бактериальной ДНК были испытаны методы с использованием додецилсульфата натрия (ДСН) в комплексе с протеиназой К, а также детергента Nonidet P-40 и Тween 20 с последующей фенольной депротеинизацией. Лучшие результаты при выделении ДНК из бактерий Pasteurella multocida достигались при обработке суспензии детергентом – 10 % ДСН в сочетании с протеиназой К, с последующей экстракцией

фенол/хлороформом. Отношение оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК Pasteurella multocida имело средние значение 1,94  0,04 (n=5). Данный метод обеспечивал более высокий выход нативной нуклеиновой кислоты до 80 %.

2 Проведенный реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida позволил показать, что размер геномной ДНК штамма Pasteurella multocida 90, составляет 2,353  8 п.о. Результаты наших исследований согласуются с данными литературы.

3 Основным этапом при разработке ПЦР является разработка праймеров для детекции, в нашем случае, ДНК Pasteurella multocida.

Правильный подбор пар праймеров является одним из основных факторов, влияющих на специфичность реакции. Для конструирования и компьютерного моделирования олигонуклеотидов был проведен поиск и отбор нуклеотидной последовательности отдельных генов генома Pasteurella multocida. Поиск проводили на сайте NCBI с базой данных GenBank, Результаты поиска показали, что в Genbank депонирована одна полная нуклеотидная последовательность генома Pasteurella multocida ( NC006623 ) и множество отдельных генов.

С использованием компьютерных программ были определены наиболее консерватиные и вариабельные участки гена pfhB1, которые были использованы для подбора праймеров. Для наибольшей специфичности праймерам учитывали все критерии, предъявляемые к олигонуклеотидам для ПЦР. В результате компьютерного анализа было сгенерировано 21 пара праймеров, которые в дальнейшем проходили апробацию. Была отобрана пара праймеров для проведения ПЦР, которые были названы Рm pfhB1- F (прямой) и Рm pfhB1- R(обратный), а продукт амплификации составлял 372 п.о.

4 В результате проведенных экспериментальных работ по подбору оптимальных температурно-временных параметров амплификации и определению состава реакционной ПЦР смеси были определены2,353  8 (n=5) п.о условия постановки ПЦР, при которых происходит специфическая наработка ПЦР продукта размером 372 п.о. и в достаточном количестве. На основании полученных данных можно заключить, что для наработки специфического продукта достаточно 0.05 ед. активности фермента в реакционной смеси. Концентрация магния существено не влияет на процесс амплификации. Так же не оказывают существенного положительного эффекта на специфичность и добавочные компоненты. только буферные растворы следующего состава (6-100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl,7- 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМ MgCl2, 250 мМ KCl и 9 - 100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl) приводят к ингибированию реакции. Суммируя все вышеизложенные результаты по оптимизации компонетов, мы использовали реакционную смесь следующего состава: