Применяется и реакция диффузионной преципитации (РДП), где для изготовления антигена К.П.Чепуров обрабатывается взвесь пастерелл в физиологическом растворе двукратным объемом хлороформа. А.Н.Борисенкова получала антигены из выращенной на МПА с 10% аминопептидом 2-суточной культуры пастерелл, смытых физиологическим раствором и прогретых в водяной бане при 56-580 С в течение 30 мин. После 20-минутного центрифугирования при 5000 об/мин супернатант был использован в качестве антигена [143,144]. Гипериммунные сыворотки получают путем иммунизации кроликов эталонными штаммами. Для этих целей используется та же методика гипериммунизации кроликов, как и в РА. Сыворотки и антигены в реакции использовали неразведенными, в эквивалентных объемах. Чашки Петри с реагентами помещали во влажную камеру при комнатной температуре, реакцию учитывали при постановке РДП в макромодификации в чашках Петри через 24-72 часа, а в микромодификации (на стеклянных пластинках 9 х 12) - через 18-24 часа. В обоих случаях использован агар Дифко [145].
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) в настоящее время считается наиболее точной серологической реакцией для выяснения иммунобиологического состояния. G.R.Carter применял ее для изучения иммунитета у птиц, иммунизированных против пастереллеза. Чаще она используется для идентификации различных серотипов пастерелл, имеющих капсулу. Реакцию ставят и учитывают по общепринятой методике в пробирках или на плексиглазовой пластинке с углублениями [146]. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен в начале 70х годов тремя группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США. К концу ХХ века этот метод прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. На сегодняшний день ИФА-диагностика является наиболее часто используемым диагностическим методом. В настоящее время в России и Казахстане для исследований на пастереллез животных используется набор для выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida) иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция). Сущность ИФА пастереллеза, так же как и других болезней животных, заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при определенной
длине волны. Результат выражают в единицах оптической плотности [147]. Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики. В то же время метод ИФА в различных его модификациях мало эффективен в случае необходимости дифференциации типовой и штаммовой принадлежности микроорганизмов. ИФА выявляет белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции [148].
В последнее время, к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний животных добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий.
К концу 90-х г. в микробиологической практике получило широкое развитие использование новых методических подходов, как в прикладном, так и фундаментальном аспекте. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы - рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике стало возможным в немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [149,150].
Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным анализ специфических ДНК-последовательностей многих патогенных микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и
относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких, как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов [151,152].
Основное преимущество этих методов, по сравнению с иммунологическими, состоит в возможности их использования при латентных и хронических инфекциях для широкого спектра патогенных микроорганизмов, а также определять генетическое родство возбудителей [153].
Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличаются друг от друга содержанием пуриновых и пиримидиновых оснований, которые формируют комплементарные пары в антипараллельных цепях ДНК. Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или схожее содержание ГЦ-пар в ДНК, а далеко отстоящие в генетическом отношении сильно отличаются по относительному содержанию этих азотистых оснований.
Более тонким методом оценки генетического сходства организмов является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов [154].
В настоящее время наиболее приемлемой филогенетической системой классификации прокариот является система, основанная на сопоставлении последовательности нуклеотидов в 16 S РНК. Эта система положена в основу «Руководства по систематической бактериологии Берджи» 2001 года. По Берджи пастереллы относятся к Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Pasteurellales, Pasteurellaceae, Pasteurella [90].
Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli принадлежат к γ подразделу протеобактерий, и включают очень много патогенных Гр- бактерий. Проведенный сравнительный анализ всего генома позволяет исследовать сравнительную эволюцию этих организмов в геномной лестнице. Установлено эволюционное родство между Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli [155].
В 1985 году появилась первая статья, описывающая революционизирующую технологию - полимеразную цепную реакцию - ПЦР. Множественные (амплифицированные в миллион раз) копии определенных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью ПЦР. В настоящее время, метод ПЦР или специфической амплификации ДНК широко используется как для диагностики, так и для дифференциации различных групп микроорганизмов. ПЦР поднимает лабораторную диагностику на иной уровень определения ДНК или РНК, что позволяет
