прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. Внедрение метода в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в медицине и ветеринарии за последнее время. По данным журнала Labmedica International с 1995 г. наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста ее использования. В 1996 г. на ДНК-диагностику было потрачено 181.6 млн. долларов, а в 2002 г. затраты возросли до 1400 млн. долларов [156,157] .
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования – амплификации, специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой , как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизмов (specific PCR). Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей – множественная ПЦР (multiplex PCR) [158,159]. Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. В ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение в виду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом [160]. Альтернативный подход в ПЦР диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы: небольших (рода, семейства) или крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических организмов. Полученные в
результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем идентифицированы молекулярными методами (секвенирование), чтобы сравнить амплифицированную ДНК с соответствующими последовательностями известных видов. [161,162,163,164,165]. На практике обычно используют менее трудоемкие и дорогостоящие методы, чем секвенирование которые, тем не менее, позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов [166,167,168]. ПЦР широко используется не только для идентификации, но также и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно, при проведении эпизоотологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. На практике выбор определенного метода типирования зависит от характера и целей проводимого эпизоотологического исследования, с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации и т.д. Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов [169,170,171]. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день
является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжевокрасной области видимого спектра (590 нм). Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦРлабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов [172,173].
Метод вертикального электрофореза. Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют . [174,175]
Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов (искусственно синтезированных участков ДНК) с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными приборами. В этом случае чаще всего используют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой в ИФА. Гибридизационные методы не получили пока широкого распространения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости методических манипуляций. Однако они интересны с точки зрения
