массового скрининга, т.к. при наличии соответствующего оборудования могут быть легко автоматизированы [176,177,178,179].
Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15- 30 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или генов человека.
Дизайн праймеров (primer design) дословно с английского можно перевести как моделирование или конструирование праймеров. Сочетание из этих слов появилось вместе с тем, как была открыта полимеразная цепная реакция [180,181].
Дизайн праймеров – это не просто выбор праймеров. Сложность проводимой предварительной теоретической работы, связанной с дизайном праймеров, в значительной степени зависит от их дальнейшего назначения (применения). В ходе протекания полимеразной цепной реакции образуется продукт, называемый амплификатом. Амплификат содержит смесь ампликонов – основного, специфического, и побочных, неспецифических – отдельных продуктов реакции, отличающихся друг от друга длиной фрагмента (молекулярной массой). В идеале – это образование одного основного ампликона, который и является специфическим для выбранной пары праймеров [182,183,184,185,186,187].
Праймер, используемый в ПЦР, имеет специальное название – амплимер.
Конструирование праймеров проводится для решения одной из следующих задач:
1 Получение ПЦР-фрагмента, несущего видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для диагностики какого-либо заболевания (инфекционного или генетического); 2 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.) для клонирования в экспрессионный вектор или создания новых генетических конструкций;
3 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.) для последующего прямого секвенирования – определения первичной нуклеотидной последовательности – или для клонирования в вектор с целью последующего секвенирования;
4 Получение ПЦР-фрагмента, несущего родоили видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для дифференциальной диагностики в пределах рода или таксона более высокого порядка; 5 Получение смеси специфических ПЦР-фрагментов в ходе проведения мультиплексной ПЦР для одновременной диагностики одного или нескольких заболеваний (инфекционных и/или генетических) [188]. Подбор эффективных праймеров – процесс эмпирический, соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения хороших праймеров: нужно выбирать праймеры с содержанием GC пар =50% и случайным распределением оснований. Следует избегать использования праймеров с протяженными полипуриновыми, полипиримидиновыми и другими неординарными последовательностями, а также последовательностей с устойчивыми вторичными структурами.
Необходимо поверять затравки на комплементарность друг другу, очевидно, что праймеры отжигающиеся с друг другом не смогут участвовать в амплификации интересующей нас последовательности.
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие – ложноотрицательный результат. Иными словами, если предполагается разработать видоспецифический праймер на какой либо микроорганизм, выбирается именно та зона, которая удовлетворяет этим требованиям в пределах нуклеотидных последовательностей генома данного вида. И, наоборот, в этих последовательностях должны быть как можно более существенные отличия среди всех близкородственных видов [189,190,191,192,193].
Среди множества различных направлений клинической диагностики ветеринарная микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода существенно расширило возможности современной практической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах. Hunt ML, Adler B, Townsend KM. в статье «The molecular biology of Рasteurella multocida» отмечают, что современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез, генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная картография, очень увеличили
наше понимание Pasteurella multocida, и предоставили исследователям много молекулярных инструментов для изучения патогенеза и эпизоотологии данного возбудителя на молекулярном уровне [194]. Учеными многих стран проводятся исследования по разработке различных методов ПЦР для идентификации штаммов Pasteurella multocida. Biswas A, Shivachandra SB, Saxena MK, Kumar AA, Singh VP, Srivastava SK. отмечают, что молекулярные методы выявления и типирования превосходят обычные методы исследований геморрагической септицемии [195].
Miflin JK, Blackall PJ., с целью разработки быстрого диагностического теста для идентификации Pasteurella multocida, разработали ПЦР анализ, используя праймеры полученные на последовательность гена 23 rRNA Pasteurella multocida. ПЦР исследование правильно идентифицировало все 144 исследованных изолята Pasteurella multocida, включая штаммы трех подвидов и референтные штаммы для типирования по схеме Heddleston и Carter. Из 20 проверенных близкородственных бактерий из семейства Pasteurellaceae только штаммы типа Pasteurella canis biovar 2 и Pasteurella avium biovar 2 были положительны. Эти две бактерии, прежде известные как Bisgaard Таксон 13, являются самыми близкими филогенетическими родственниками Pasteurella multocida, основанными на 16S рибосомальной рРНК. Все проверенные филогенетически несвязанные штаммы других возбудителей, выделенные от птиц и свиней, были отрицательны. Данный метод на основе ПЦР позволяет быстро идентифицировать колонии Pasteurella multocida птичьего или свиного происхождения. Авторы рекомендуют использовать данную модификацию ПЦР для быстрой и точной диагностики холеры домашней птицы и пастереллеза свиней [196].
Sellyei B, Varga Z, Ivanics E, Magyar T охарактеризовали и сравнили биохимическими тестами, методами капсульного типирования ПЦР и ERIC-ПЦР 61 штамм Pasteurella multocida, выделенные от различных видов птиц, представляющих различные географические области Венгрии. По результатам исследований, основанным на анализе группы штаммов, были выделены четыре большие и четыре минигруппы, которые показали значительную корреляцию с географическим происхождением и видом хозяина. Результаты их исследований показали, что ERIC-ПЦР может быть подходящей методикой для изучения адаптации Pasteurella multocida к хозяину и эпизоотологии возбудителя пастереллезов домашней птицы [197].
Saxena MK, Kumar AA, Chaudhari P, Shivachandra SB, Singh VP, Sharma B. оценивали применимость риботипирования основанного на 16S рРНК и 23S рРНК. Были риботипированы 48 изолятов Pasteurella multocida изолированных от различных хозяев и географических мест
