Индии и один референтный изолят. Исследователями выявлено только четыре риботипа. Все изоляты, включая референтный от диких плотоядных животных, имели один и тот же риботип, хотя у них были различные серотипы. Один изолят от тигра имел дополнительную группу к представленным в главном риботипе группам. Изоляты от львов представляли два риботипа; из этих риботипов один (r2) имел дополнительную группу 3.6 kbp, которая отсутствовала во всех других риботипах. У второго риботипа (r4) от льва отсутствовала одна группа (6 kbp), которая присутствовала в другом риботипе. Изоляты были далее типированы, используя методы ERIC-ПЦР и REP –ПЦР, в результате чего были получены индексы дискриминации (D) 0.83 - 0.89. Данное исследование показало, что риботипирование не очень эффективный инструмент молекулярной эпизоотологии для видовой дифференциации изолятов [198].
Liu D, Lawrence ML, Austin FW. идентифицировали два гена - Pm0762 и Pm1231 - уникальных для P. multocida. Используя разработанные для этих генов олигонуклеотидные праймеры (Pm0762F/R и Pm1231F/R), получили специфичные продукты ДНК ожидаемых размеров только от геномной ДНК P. multocida. Результаты их исследований показали, что предполагаемые гены регуляторы транскрипции - Pm0762 и Pm1231 - являются специфичными для видов P. multocida и методы ПЦР, предназначающиеся для этих генов, обеспечивают быструю и точную идентификацию P. multocida от других бактерий; способствуют объяснению ролей и функций этих генов и их белковых продуктов, а также являются ценными для понимания молекулярного механизма вирулентности P. multocida [199].
Nagai S, Someno S, Yagihashi T. разработали ПЦР анализ для дифференцирования вирулентных штаммов Pasteurella multocida subsp. multocida от авирулентных штаммов на основе toxA гена. Был амплифицирован toxA ген, кодирующий 143-kDa дермонекротического токсина, который, как полагают, является центральным этиологическим фактором прогрессирующего атрофического ринита свиней. Полученные результаты ПЦР 187 областей ДНК изолятов P. multocida, были совместимы с результатами тестов на коже морских свинок и анализа иммуноблотинга [200].
Fisher MA, Weiser GC, Hunter DL, Ward AC. провели исследования методом ПЦР для определения леукотоксина lktA - структурного гена Pasteurella - в изолятах Pasteurella haemolytica и P trehalosi и коррелляции их бета – гемолитической деятельности с обнаружением lktA гена. Производство и секреция леукотоксина - главный фактор вирулентности, когда другие условия благоприятны для развития болезни. Было исследовано147 изолятов Pasteurella haemolytica от 21 биовариантных групп, и 101изолят Pasteurella trehalosi от 7
биовариантных групп. LktA ген был обнаружен в 108 (44 %) изолятах, включая 15 связанных с болезнями дыхательных путей. Все кроме 2 (98 %) изолятов, у которых был lktA ген, были бета-гемолитиками когда выращивались на кровяном агаре овец [201].
Boucher DJ, Adler B, Boyce JD. использовали множество методов, чтобы идентифицировать факторы вирулентности Pasteurella multocida, включая технологию экспрессии in vivo (IVET). Ими был сконструирован изогенный штамм P. multocida , который не был способен редуцировать нитриты при аэробных и анаэробных условиях, таким образом, демонстрируя, что nrfE ген P. multocida является существенным для редукции нитритов. Однако, nrfE мутант оставался вирулентным для мышей. Анализ ОТ-ПЦР в реальном времени показал, что nrfE был отрегулирован независимым от nrfABCD покровителем, который, вероятно, является сорегулятором в естественных условиях [202].
С целью получения больших данных о молекулярной биологии Pasteurella multocida Ewers C, Lübke-Becker A, Bethe A, Kiebling S, Filter M, Wieler LH. исследовали методом ПЦР и ДНК-ДНК гибридизации гены капсульного биосинтеза (capA, B, D, E, и F) и 14 вирулентно ассоциативных генов 289 штаммов, изолированных от различных клинически здоровых и больных животных. Как ожидалось, штаммы капсульного типа были чрезвычайно адаптированы к крупному рогатому скоту (92.3 %) и домашней птице (85.7 %), в то время как, capA (34.9 %) и capD (58.1 %) - позитивные штаммы выделены от свиней. Значимое количество capD-положительных штаммов выделены от мелкого рогатого скота (34.9 %) и capF - в штаммах дикого типа от больного крупного рогатого скота (2.2 %) и кошек (7.4). Гены toxA, tbpA и pfhA предположительно так же, как гены капсульного биосинтеза, являются важными эпидемиологическими генами маркерами для того, чтобы характеризовать штаммы Pasteurella multocida [203].
Orth J.H., Aktories K., Kubatzky K.F. методами ПЦР выяснили, что токсин Pasteurella multocida (PMT) вызывает активацию STAT белков, и идентифицировали STAT1, STAT3, и STAT5 белки как новые цели PMT индуцированных Galpha (q) сигналов. Поскольку конститутивная активация STAT белков была найдена во многих раковых образованиях, результаты данных исследований предлагают новый механизм канцерогенной роли PMT [204].
Tang X, Zhao Z, Hu J, Wu B, Cai X, He Q, Chen H. в 2009 году исследовали в общей сложности 233 изолята Pasteurella multocida на чувствительность к 20 антибиотикам и присутствие 19 генов факторов вирулентности (VFs), полученные от 2 912 случаев клинического пастереллеза свиней в Китае. Частота антибактериальной резистентности среди изолятов P. multocida, выделенных от свиней в
Китае, была выше чем, среди изолятов P. multocida, выделенных от свиней в других странах, и 93 % изолятов показали многократную устойчивость к антибиотикам. Профили резистентности указывают, что цефалоспорины, флорфеникол, и флуороквинолон (fluoroquinolones) были лекарствами наиболее активными против Pasteurella multocida. Использование ПЦР показало, что факторы вирулентности (ptfA, fimA, и hsf-2), факторы усвоения железа и наружные мембранные белки распространены в большинстве свиных штаммов. Факторы вирулентности - pfhA, tadD, toxA, и pmHAS, каждый, были представлены в около 50 % штаммах. Различные факторы вирулентности показали отдельные ассоциации с серогруппами: сконцентрированные в серогруппе A, сконцентрированные в серогруппе D, или находящиеся совместно в серогруппах A и D [205]. Townsend KM, Frost AJ, Lee CW, Papadimitriou JM, Dawkins HJ. путем геномной гибридизации близкородственных изолятов Pasteurella multocida, получили клоны, полезные для идентификации штаммов типа B от других серотипов P. multocida, вызывающих геморрагический сепсис. Олигонуклеотидные праймеры, разработанные на последовательность этих клонов оказались ценными в разработке ПЦР анализа для быстрой видо- и типоспецифичной идентификации Pasteurella multocida, и типа B:2, в частности. Это исследование показало, что пара праймеров сконструированная на последовательности клона 6b (KTT72, и KTSP61) амплифицировала специфичный фрагмент ДНК серотипов B:2, B:5, и B:2,5 P. multocida и что праймеры, KMT1T7 и KMT1SP6 амплифицировали, уникальный для всех проанализированных изолятов Pasteurella multocida продукт. По мнению ученых, ПЦР амплификация, выполненная непосредственно на бактериальных колониях или культурах представляет чрезвычайно быстрый, чувствительный метод идентификации P. multocida [206].
Индийские ученые разработали метод ПЦР анализа, основанный на последовательности гена hyaC-hyaD, для идентификации штаммов Pasteurella multocida серогруппы A. Сконструированные серогруппоспецифичные праймеры амплифицировали продукт размером 564 пн геномной ДНК, выделенной из бактериальных клеток или непосредственно бактериальных колоний. У этого метода, обнаруживающего 10 нанограммов бактериальной ДНК была 100 % специфичность для P. multocida серогруппы A. Метод nested ПЦР привел к единственным 374 bp продуктам. Все пятьдесят изолятов, как показал также анализ рестрикции полиморфизма длин фрагментов ( ПДРФ -RFLP) с BglII., были идентичны продуктам ПЦР [207].
Они изучили применимость обычных и молекулярных методов для быстрого выявления и дифференцирования Pasteurella multocida серогруппы B изолированных от индийских буйволов при вспышке
