геморрагической септицемии в Индии. Было получено пять изолятов, которые были подвергнуты фенотипической и генотипической характеристике. Ни один из этих пяти изолятов, не мог быть дифференцирован на основе культуральных, биохимических методов, патогенности и антибактериальной чувствительности. Методы на основе ПЦР были специфичными и чувствительными для быстрого выявления и дифференцирования изолятов. Методами REP - ПЦР, ERICПЦР, ПЦР с одним праймером дифференцировали различные профили всех пяти изолятов. У всех изолятов, генетический профиль отличался от стандартного штамма P. multocida - P52. Однако, три изолята, имели идентичные профили, тогда как, у каждого из оставшихся двух был различный профиль. Исследование указывает на причастность многих штаммов P. multocida к одной вспышке геморрагической септицемии буйволов. Результаты также показывают, что молекулярные методы выявления и типирования P. multocida превосходят обычные методы для быстрых эпизоотологических исследований геморрагической септицемии [208].
Также применимость молекулярных методов изучена для обнаружения и дифференцирования штаммов Pasteurella multocida, вовлеченных в две отдельных вспышки пастереллеза домашней птицы на одной птицеферме. В общей сложности 12 и 18 штаммов P. multocida выделенные из двух отдельных вспышек были подвергнуты фенотипической и генотипической характеристике. Фенотипически, все штаммы были подобны; однако методы ПЦР анализа были очень специфичными и чувствительными для быстрого выявления и дифференцирования штаммов. Все 30 штаммов дали ампликоны приблизительно 460 п.о и 1 044п.о, специфичные для P. multocida и капсульных серогрупп в мультиплексной капсульной ПЦР типирующей системе. Молекулярные методы типирования, такие как REP -ПЦР , ERIC- ПЦР и ПЦР с одним праймером дифференцировали все 30 штаммов в различные профили. Однако, по результатам анализа эндонуклеазной рестрикции, с использованием фермента HpaII, сходные образцы фрагментов генома наблюдались среди всех штаммов. Исследование показало причастность тех же самых многочисленных штаммов P. multocida к двум вспышкам [209].
Pasteurella multocida состоит из трех подвидов, которые часто дифференцируются ферментированием сорбита и дульцита. Hunt Gerardo S, Citron DM, Claros MC, Fernandez HT, Goldstein EJ. изучили 35 дульцитол-отрицательных изолятов P. multocida, выделенных из инфицированных укушенных ран собак и кошек, 16 из которых привели к слабым или противоречивым реакциям сбраживания сорбитола, таким образом мешая различать два дульцитол - отрицательных подвида P. multocidа: P. multocida subsp. multocida и P. multocida subsp. septica. Все
изоляты, и два контрольных штамма далее были проанализированы, используя ПЦР метод геномных «отпечатков пальцев» с одним праймером (ядро M13) и по альфаглюколидазной активности (альфаGlu). По результатам данных исследований ПЦР метод геномных «отпечатков пальцев» и оценка альфа-Glu деятельности являются надежными методами дифференциации P. multocida subsp. multocida от P. multocida subsp. septica, особенно в штаммах, которые слабо или несоответственно ферментируют сорбитол [210].
Капсула штаммов ATCC 11039 серотипа А Pasteurella multocida состоит из гиалуроновой кислоты и является важным фактором вирулентности. Повторное субкультивирование определенных штаммов капсульных серотипов приводит к диссоциации от капсульных до акапсульных фенотипов с сопутствующей потерей вирулентности. Хотя акапсульные варианты, как полагали, возникли в результате мутации, молекулярные механизмы, лежащие в основе этого процесса, неизвестны. Watt JM, Swiatlo E, Wade MM, Champlin FR. продемонстрировали, что восстановление капсульного фенотипа происходит в естественных условиях в результате внутрибрюшинного заражения мышей BALB/c акапсульным вариантом. Кроме того, анализ ОТ-ПЦР показал капсульный локус, находящийся под транскрипционным контролем. Клонирование и секвенирование 290-п.о. фрагмента в пределах промотора, содержащего интергенный регион капсульного локуса 11039/iso, показали, что после субкультивирования не произошло никаких существенных изменений. Эти результаты демонстрируют, что штамм ATCC 11039 серотипа А P. multocida, регулирует капсульную экспрессию в ответ на неопознанный фактор среды, таким образом обеспечивая способность проникновения в суть молекулярных механизмов, лежащих в основе диссоциации колоний [211]. Shivachandra SB, Kumar AA, Chaudhuri P. использовали REPПЦР, ERIC - ПЦР, и ПЦР с одним праймером для молекулярной характеристики 66 птичьих штаммов Pasteurella multocida серогруппы A:1, изолированных от разных видов птиц, из различных областей Индии. REPПЦР привела к амплификации повторных последовательностей генома, в диапазоне примерно от 200 до 3000 п.о., которые составляли в общей сложности 54 различных профиля (D=0.99). Анализ ERIC-ПЦР также произвел амплифицированные продукты в диапазоне приблизительно от 200 до 3200 п.о., категоризирующие штаммы в общей сложности 50 различных профилей (D=0.98). Амплификация повторных областей, используя микросателлитные праймеры (GTG), привела к четко дифференцированным группам в пределах приблизительно от 200 до 2400 п.о. Штаммы были разделены на 43 профиля (D=0.96). Генотипные
профили птиц-хозяев не коррелировали с географической областью их происхождения. Птичьи штаммы P. multocida серогруппы A:1, были очень гетерогенными с разнообразными профилями. Метод REP-ПЦР, как показали исследования, очень специфичен и прост для дифференцирования фенотипически подобных штаммов. Данное исследование также показало, что ПЦР основанный на амплификации повторных областей P. multocida – быстрый метод с хорошей дискриминацией, который может использоваться непосредственно для рутинного типирования изолятов выделенных при вспышках пастереллезов домашней птицы [212].
Leotta GA, Chinen I, Vigo GB, Gugliada J, Rivas M. провели исследования для оценки двух методов молекулярного типирования - ERIC-ПЦР и Apal-PFGE, с целью изучения Pasteurella multocida. Были определены видовые особенности, воспроизводимость, и отличительные особенности, для установления генетического родства штаммов P. multocida. Были изучены сорок девять штаммов из различных источников, биотипов, капсульной группы, соматических серотипов, и резистентности к антибактериальным препаратам. В ERIC-PCR был определен 31 образец 10 - 14 групп в размере 0.2 и 1.2 КБ. В Apal-PFGE были установлены 37 рестриктированных образцов 7 - 15 групп в размере 34 - 450 КБ. Типоспецифичность составляла 100 % (T=1) для ERIC-PCR, и 94 % (T = 0.94) для Apal-PFGE. Воспроизводимость обоих методов составляла 100 %, разделение на профили составляло 93 % (D = 0.93) для ERIC-ПЦР, и 98 % (D = 0.98) для Apal-PFGE. При использовании обоих методов, эпизоотологически связанные штаммы были сгруппированы, несвязанные штаммы были четко дифференцированы [213].
Бельгийскими учеными был исследован 141 изолят Pasteurella multocida, и 34 изолята Mannheimia haemolytica sensu lato, выделенных из верхних дыхательных путей здоровых телят, для сравнения классического фенотипирования с тДНК – ПЦР генотипированием, и с другой стороны, попарным сравнением результатов дисковой диффузии в агаре для семи антибактериальных составов (ампициллин, цефтиофур, окситетрациклин, гентамицин, флорфеникол, энрофлоксацин и триметоприм. Фенотипирование и генотипирование хорошо коррелировали (> 90 %). Попарные сравнения методов чувствительности к антибиотикам были исследованы традиционно посредством расчета погрешности обязательных норм специфичности и чувствительности и особенностей методики. Специально определявшаяся чувствительность для старых антибактериальных агентов (окситетрациклин, гентамицин, триметоприм) часто оказывалась ниже 85 %. Почти для всех антибактериально-бактериальных комбинаций специфичность превысила 90%. Ученые пришли к заключению, что метод дисковой
