диффузии надежен в эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга [214.]
Российские ученые Афонюшкин В.Н., Коптев В.Ю., Юшков Ю.Г., Шкиль Н.А. разработали мультиплексную ПЦР для детекции геномной ДНК P. aerugenosa и микроорганизмов рода Pasteurella и синегнойной палочки в патологическом материале сельскохозяйственной птицы. Мультиплексная ПЦР позволяет контролировать наличие определенного спектра микроорганизмов в одной реакции. По мнению ученых к негативным факторам, ограничивающим применение мультиплексных ПЦР в системе скрининга и мониторинга различных инфекций относят более высокий риск неспецифических реакций ввиду наличия в реакционной смеси нескольких пар праймеров и снижение чувствительности реакции в связи с конкуренцией за компоненты реакционной смеси при синтезе нескольких разных ампликонов [215].
Однако в ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение ввиду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом.
Пастереллез и псевдомоноз с./х птицы обычно сопровождается инфицированием одних и тех же органов и тканей (легкие, сердце, паренхиматозные органы) поэтому использование мультиплексной ПЦР будет вполне уместно для дифференциальной диагностики, в то же время биологические особенности пастерелл и псевдомонасов не создают существенных предпосылок для развития ассоциированных инфекций. В этой связи, риск конкурентного ингибирования одной из реакций – минимален.
1.3 Геном бактерии пастереллеза и кодируемые им белки P. multocida является мультипатогенным возбудителем, индуцирующим инфекционные патологии у многих видов млекопитающих и птиц.
Из многочисленных факторов вирулентности P. multocida наиболее значимыми являются полисахариды капсулы, эндотоксины или липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии и адгезины, экзотоксины, внеклеточные ферменты (липаза, гиалуронидаза) и др. [].
В 2001 году Barbara J. May [216] c сотрудниками из Национального центра токсикологии и безопасности питания университета штата Мичиган методом случайного секвенирования и компьютерного анализа провели исследования 53 000 фрагментов последовательностей штамма Pm 70, которые были, затем собраны в одинарную циркулярную последовательность 2 257 487 п.о.
Геном Pasteurella multocida (Pm 70) – одинарная циркулярная хромосома, состоит из 2 257 487 пар оснований в длину, содержит 2 014 потенциально кодирующих регионов, размером, в среднем, 998 п.о., которые составляют 89 % от всей хромосомы. Оставшиеся 11% последовательностей – 6 полных рРНК оперонов (16S – 23S -5S); 57 тРНК генов представляют все 20 аминокислот и сравнительно небольшое количество некодирующих элементов. 26% кодирующих последовательностей белков с неизвестными функциями большей частью идентичны последовательностям белков, расшифрованным в других полных микробиологических геномах.
Геном Pasteurella multocida кодирует целиком путь метаболизма ферментов, цикл глюколизиса, глюконеогенезиса и трихлорацетиловой кислоты. Этот путь также представлен в обоих геномах Haemophilus influenzae и Escherichia coli. Геном Pasteurella multocida, подобно геномам Haemophilus influenzae и Escherichia coli кодирует полностью путь синтеза всех 20 аминокислот, а также пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. В противоположность к Escherichia coli, пути катаболизма нескольких аминокислот, включая аспарагин, лейцин, гистидин, лизин и фенилаланин, отсутствуют у Haemophilus influenzae и Pasteurella multocida. В этих бактериях представлен сложный путь усвоения сульфатов, а также метаболизм нитратов и фолиевой кислоты.
По результатам определения и анализа полной нуклеотидной последовательности генома P. multocida выявлено 104 гена, ассоциированных с вероятными факторами вирулентности данного микроорганиза, что составляет около 7% от всего генома P. midtocida. Эти гены выполняют различные функции: адгезия и
проникновение в клетку хозяина, приобретение железа, порины наружной мембраны, нейроминидазы, супероксид дисмутазы, выроботка дерманекротоксина и гиалуронидаза. Образование капсулы является одним из факторов вирулентности.
Таблица 1 – Гены, ассоциированные с вирулентностью Pasteurella multocida
| Наименование гена | Выполняемые функции |
|---|---|
| ToxA | dermanecrotoxin |
| pfhВ1/pfhB2 | Filmentous hemagglutinin |
| hgbA | hemoglobin-binding protein/iron uptake |
| hgbB | hemoglobin-binding protein/iron uptake |
| exbBD-tonB | Iron acquisition |
| nanH | Neurominidase/sialidase |
| Psl | porin |
| nanB | Neurominidase/sialidase |
| omp H | outer membrane protein H |
| omp87 | Outer membrane protein 87 |
| ptfA | Type 4 fimbriae |
| sodА | superoxide dismutase |
| sodC | superoxide dismutase |
| tbpA | transferrin binding protein |
| fimA | fimbriae |
| hsf1 | Autotransporter adhesion |
| hsf2 | autotransporter adhesion |
| tadD | putative nonspecific tight adherence protein |
| Fur | ferric uptake regulation protein |
| pmHAS | Hyaluronan synthase |
| ompA | outer membrane protein A |
| plpB | lipoprotein B |
| Rci | recombinase |
| Dam | DNA adenine methylase |
Также в ходе данного исследования было установлено, что геном данного вида пастерелл представлен одиночной циркулярной хромосомой длиной 2.257.487 пар нуклеотидов и содержит 2.014 кодирующих 4 регионов, средний размер которых 998 п.н. (в сумме 89% всей хромосомы). Оставшиеся 11% генома представлены шестью оперонами рибосомальной РНК (16S-23S-5S) и 57 генами тРНК, представляющими все 20 аминокислот, и относительно небольшим количеством некодирующих элементов. Сравнительный анализ первичной структуры микроорганизма показал наличие двухсот кодирующих регионов (10%), уникальных для P. midtocida, а также 1421 и 1329 кодирующих регионов, гомологичных таковым в геномах Hemophilus influenzae и Echerichia coli, соответственно [217]. В
