профили птиц-хозяев не коррелировали с географической областью их происхождения. Птичьи штаммы P. multocida серогруппы A:1, были очень гетерогенными с разнообразными профилями. Метод REP-ПЦР, как показали исследования, очень специфичен и прост для дифференцирования фенотипически подобных штаммов. Данное исследование также показало, что ПЦР основанный на амплификации повторных областей P. multocida – быстрый метод с хорошей дискриминацией, который может использоваться непосредственно для рутинного типирования изолятов выделенных при вспышках пастереллезов домашней птицы [212].
Leotta GA, Chinen I, Vigo GB, Gugliada J, Rivas M. провели исследования для оценки двух методов молекулярного типирования - ERIC-ПЦР и Apal-PFGE, с целью изучения Pasteurella multocida. Были определены видовые особенности, воспроизводимость, и отличительные особенности, для установления генетического родства штаммов P. multocida. Были изучены сорок девять штаммов из различных источников, биотипов, капсульной группы, соматических серотипов, и резистентности к антибактериальным препаратам. В ERIC-PCR был определен 31 образец 10 - 14 групп в размере 0.2 и 1.2 КБ. В Apal-PFGE были установлены 37 рестриктированных образцов 7 - 15 групп в размере 34 - 450 КБ. Типоспецифичность составляла 100 % (T=1) для ERIC-PCR, и 94 % (T = 0.94) для Apal-PFGE. Воспроизводимость обоих методов составляла 100 %, разделение на профили составляло 93 % (D = 0.93) для ERIC-ПЦР, и 98 % (D = 0.98) для Apal-PFGE. При использовании обоих методов, эпизоотологически связанные штаммы были сгруппированы, несвязанные штаммы были четко дифференцированы [213].
Бельгийскими учеными был исследован 141 изолят Pasteurella multocida, и 34 изолята Mannheimia haemolytica sensu lato, выделенных из верхних дыхательных путей здоровых телят, для сравнения классического фенотипирования с тДНК – ПЦР генотипированием, и с другой стороны, попарным сравнением результатов дисковой диффузии в агаре для семи антибактериальных составов (ампициллин, цефтиофур, окситетрациклин, гентамицин, флорфеникол, энрофлоксацин и триметоприм. Фенотипирование и генотипирование хорошо коррелировали (> 90 %). Попарные сравнения методов чувствительности к антибиотикам были исследованы традиционно посредством расчета погрешности обязательных норм специфичности и чувствительности и особенностей методики. Специально определявшаяся чувствительность для старых антибактериальных агентов (окситетрациклин, гентамицин, триметоприм) часто оказывалась ниже 85 %. Почти для всех антибактериально-бактериальных комбинаций специфичность превысила 90%. Ученые пришли к заключению, что метод дисковой
диффузии надежен в эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга [214.]
Российские ученые Афонюшкин В.Н., Коптев В.Ю., Юшков Ю.Г., Шкиль Н.А. разработали мультиплексную ПЦР для детекции геномной ДНК P. aerugenosa и микроорганизмов рода Pasteurella и синегнойной палочки в патологическом материале сельскохозяйственной птицы. Мультиплексная ПЦР позволяет контролировать наличие определенного спектра микроорганизмов в одной реакции. По мнению ученых к негативным факторам, ограничивающим применение мультиплексных ПЦР в системе скрининга и мониторинга различных инфекций относят более высокий риск неспецифических реакций ввиду наличия в реакционной смеси нескольких пар праймеров и снижение чувствительности реакции в связи с конкуренцией за компоненты реакционной смеси при синтезе нескольких разных ампликонов [215].
Однако в ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение ввиду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом.
Пастереллез и псевдомоноз с./х птицы обычно сопровождается инфицированием одних и тех же органов и тканей (легкие, сердце, паренхиматозные органы) поэтому использование мультиплексной ПЦР будет вполне уместно для дифференциальной диагностики, в то же время биологические особенности пастерелл и псевдомонасов не создают существенных предпосылок для развития ассоциированных инфекций. В этой связи, риск конкурентного ингибирования одной из реакций – минимален.
1.3 Геном бактерии пастереллеза и кодируемые им белки P. multocida является мультипатогенным возбудителем, индуцирующим инфекционные патологии у многих видов млекопитающих и птиц.
Из многочисленных факторов вирулентности P. multocida наиболее значимыми являются полисахариды капсулы, эндотоксины или липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии и адгезины, экзотоксины, внеклеточные ферменты (липаза, гиалуронидаза) и др. [].
В 2001 году Barbara J. May [216] c сотрудниками из Национального центра токсикологии и безопасности питания университета штата Мичиган методом случайного секвенирования и компьютерного анализа провели исследования 53 000 фрагментов последовательностей штамма Pm 70, которые были, затем собраны в одинарную циркулярную последовательность 2 257 487 п.о.
Геном Pasteurella multocida (Pm 70) – одинарная циркулярная хромосома, состоит из 2 257 487 пар оснований в длину, содержит 2 014 потенциально кодирующих регионов, размером, в среднем, 998 п.о., которые составляют 89 % от всей хромосомы. Оставшиеся 11% последовательностей – 6 полных рРНК оперонов (16S – 23S -5S); 57 тРНК генов представляют все 20 аминокислот и сравнительно небольшое количество некодирующих элементов. 26% кодирующих последовательностей белков с неизвестными функциями большей частью идентичны последовательностям белков, расшифрованным в других полных микробиологических геномах.
Геном Pasteurella multocida кодирует целиком путь метаболизма ферментов, цикл глюколизиса, глюконеогенезиса и трихлорацетиловой кислоты. Этот путь также представлен в обоих геномах Haemophilus influenzae и Escherichia coli. Геном Pasteurella multocida, подобно геномам Haemophilus influenzae и Escherichia coli кодирует полностью путь синтеза всех 20 аминокислот, а также пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. В противоположность к Escherichia coli, пути катаболизма нескольких аминокислот, включая аспарагин, лейцин, гистидин, лизин и фенилаланин, отсутствуют у Haemophilus influenzae и Pasteurella multocida. В этих бактериях представлен сложный путь усвоения сульфатов, а также метаболизм нитратов и фолиевой кислоты.
По результатам определения и анализа полной нуклеотидной последовательности генома P. multocida выявлено 104 гена, ассоциированных с вероятными факторами вирулентности данного микроорганиза, что составляет около 7% от всего генома P. midtocida. Эти гены выполняют различные функции: адгезия и
