2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и методы иследований
Исследования проводили в лаборатории «Молекулярной биологии и генной инженерии вирусов» НИИПББ НЦБ РК, лаборатории противобактериозной биотехнологи КазНАУ, НИЦ КГУ им. А. Байтурсынова, хозяйствах Костанайской и Алматинской областей.
Эпизоотическую ситуацию по пастереллезу сельскохозяйственных животных за 5 лет изучали по данным отдела ветеринарного надзора областного территориального управления МСХ РК, Костанайского областного филиала РГКП «Республиканская ветеринарная лаборатория», по результатам собственных исследований по диагностике пастереллеза крупного рогатого скота.
Для проведения экспериментальных работ исследовано 64 пробы патологического материала от 29 голов крупного рогатого скота из хозяйств в п. Прогресс, с/о Айдарлы, п. Челгаши Карасуского района, ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского района, ТОО «Викторовское» Тарановского района Костанайской области и СХПКП3 «Алматы -2» Алматинской области.
Всего было выделено 8 изолятов пастерелл, отобрано и подвергнуто всестороннему изучению биологических свойств 3 эпизоотических штамма пастерелл( К1,К2,А1) и 1 эталонный штамм Pasteurella multocida 90 из музея лаборатории противобактериозной технологии КазНАУ.
В лабораторных опытах использовано 35 белых мышей живой массой 16 – 18 г.
Для определения специфичности метода ПЦР при диагностике пастереллеза крупного рогатого скота использовали штаммы из коллекции лаборатории противобактериозной биотехнологии КазНАУ:
-
штамм Pasteurella multocida 90, 26, 46
-
штамм Escherichia coli
-
штамм Salmonella dublin
-
Salmonella typhimurium
-
штамм Listeria monocitogenes
-
штамм Brucella abortus
-
штамм Mycobacterium bovis
В работе использовали питательные среды: МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5% сыворотки крови лошади.
Среды и растворы.
В работе использовали следующие среды и растворы: 5 М NaCl, 3 M NaOH, 10 % БСА, 3 М ацетат натрия, 10 мМ дНТФ, 7 % уксусная кислота, 20 %, 30 %, 40 %, 60 % растворы сахарозы, 0,5 M ЭДТА, рН 8,0,
10 % ДСН, 10 мг/см3 этидиум бромида, 2 % ФВК, рН 6,8, 1 М KOH, 10 мг/см3 протеиназа К, 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 96 % и 70 % этанол. TВE: 89 мМ Трис-борат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА
| ТАЕ : | 40 мМ Трис-ацетат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА |
|---|---|
| ТЕ: | 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА |
| Протеиназный буфер: | 0,3 М NaCl, 25 мМ ЭДТА, 2 % ДСН, 0,2 М трис-HCl, рН 7,5 |
| Буфер для проб (2): | 100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, |
|---|---|
| 20 % (в/о) глицерин, | |
| 4 % (в/о) ДСН, | |
| 0,001 % (в/о) БФС, | |
| 2 % (о/о) 2-меркаптоэтанол, |
| Электрофорезный | буфер | 125 мМ | Трис-HCl, 0,5 % (в/о) ДСН, |
|---|---|---|---|
| (5): | 0,96 М | глицин |
| Буфер для нанесения проб: | 80 % (о/о) формамид, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,1% (в/о) бромфеноловый синий, 0,1% (в/о) ксиленцианол |
|---|---|
| 4х Трис-Cl/ДСН, рН 8.8 | 1,5 M Трис довести рН до 8,8 1n NaCl, 0,4 % ДСН |
| Буфер для ПЦР | 100 мM Трис HCl, pH 8,3, 15 мM MgCl2, 750 мM KCl |
| Буфер для отжига (×5): | 200 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl |
Оборудование:
-
синтезатор олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems;
-
термоциклер с градиентом температур Mastercycler gradient;
-
УФ бокс UVS/ T-M, Латвия;
-
РНК/ДНК калькулятор GenQuant Pro RNA/DNA Calculator,
-
Amersham-Pharmacia-Biotech;
-
аналитические весы AB 204-5/A, Mettler Toledo;
-
рН-метр Delta 320 Mettler Toledo;
-
универсальная цифровая система документации Infinity 115;
-
термоплаты Thermomixer compact, Eppendorf;
-
шейкеры, вортексы Vortex Genie 2 Shaker, МультиСпин MSС -
-
3000;
-
автоматические микропипетки, Eppendorf;
-
аппарат для горизонтального электрофореза нуклеиновых кислот
-
HU 25, Scie - Plas;
-
цифровой фотоаппарат для фотографирования гелей, Olympus;
-
пакет прикладных программ для анализа последовательностей ДНК
-
- DNASYS MAX 1.0, Sequencher, Vector NTI, BioEdit, GENEDOC, Staden package.
-
рефрижираторная микроцентрифуга " Centrifuge 5417R", Eppendorf
-
;
-
низкоскоростная центрифуга "Centrifuge 5702", Eppendorf;
-
микроцентрифуга "MiniSpin", Eppendorf;
-
ультразвуковой дезинтегратор "MSE-150", MSE;
-
источник питания "Electrophoresis Power Supply-EPS 3501",
-
Amersham-Pharmacia-Biotech.
Методы исследований.
Мониторинг эпизоотической ситуации по пастереллезу в Костанайской области проводили по данным ветеринарной отчетности Костанайской областной ветеринарной инспекции, Костанайского филиала РГКП «Республиканская ветеринарная лаборатория», результатам собственных исследований.
Выделение эпизоотических штаммов Pasteurella multocida проводили от больных и павших голов крупного рогатого скота из хозяйств Костанайской и Алматинской областей. Культурально - морфологические, биохимические, вирулентные свойства эпизоотических штаммов пастерелл изучали по общепринятым методикам.
Для выращивания культур штаммов пастерелл производили посевы на МПБ и МПА, питательные среды Хоттингера с добавлением 5% сыворотки лошади. Посевы инкубировали в термостате в течение 18 часов. Готовили суспензии из паренхиматозных органов, мазки из органов и крови сердца мышей, мазки из выращенных суточных культур. Мазки окрашивали по Граму, синькой Леффлера и по Романовскому - Гимза.
Биохимические свойства пастерелл изучали на средах Гисcа. Пастереллы расщепляли глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит с образованием кислоты без газа, не разжижали желатин, образовывали индол.
Выделение ДНК из бактериальной культуры Pasteurella multocida проводили обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой К.
