В суточную культуру возбудителя добавляли протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/см³ , ДСН до конечной концентрации 0,5 %. Полученную смесь инкубировали при 56⁰ С в течение 1 ч, при этом происходил лизис и выделение ДНК.

ДНК очищали двукратным экстрагированием равными объемами фенола и фенол/хлороформа. Каждую экстракцию проводили медленным переворачиванием пробирки. Фенольную и водную фазы разделяли центрифугированием при 15600 g, при комнатной температуре в течение 5 мин на центрифуге "Eppеndorff''. Конечную водную фазу отбирали и экстрагировали равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (96:4). Водную фазу отбирали и к ней добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного 96 % этанола. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при минус 20⁰ С в течение 1 ч.

Осаждение ДНК проводили центрифугированием при 15600 g в течение 15 мин при температуре 4⁰ С. Осадок ДНК дважды промывали 70 % этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в необходимом объеме ТЕ буфера.

Чистоту полученных препаратов ДНК определяли спектрофотометрически по отношению оптических плотностей при длинах волн 260 нм и 280 нм (Е260/Е280). Для чистых препаратов ДНК это отношение должно быть равно 1,8 и выше. Если это отношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом. В этом случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию фенол/хлороформом.

При выделениеи ДНК Pasteurella multocida из органно-тканевых материалов образцы исследуемого биологического материала (легкие, лимфоузлы) мелко нарезали с помощью скальпеля и помещали в ступки с песком. Материал растирали до образования однородной массы, и добавляли физиологический раствор для получения 20 % суспензии (вес/объём). Далее выделение бактериальной ДНК проводили по выше описанной методике.

Кровь для исследования консервировали 3% раствором трилона Б. При перхлоратном методе цельную кровь в первый день ставили на лизис:

• на 200 мкл цельной крови добавили 1 мл ТЕ буфера и перемешивали в течение 1 минуты на вортексе, затем центрифугировали при 7500 об/мин в течение 1 минуты. Затем супернатант сливали так повторяли 2-3 раза, до получения супернатанта розового цвета; аккуратно сливали верхний слой и добавляли 300 мкл лизирующего буфера и 8 мкл. протеиназы К; ставили в термостат при +63⁰ С на 12-14 часов. На следующий день для продолжения процесса выделения ДНК в каждую пробирку добавляли реагенты: 50 мкл перхлората натрия и

мешали на шейкере около 5 минут; 300 мкл CIA, мешали на шейкере около 5 минут; центрифугировали 15 об/мин в течение 1 минут; верхнюю фракцию после разделения сред снимали дозатором и добавляли 600 мкл 96⁰ С этилового спирта, встряхивали пробирку, в результате ДНК выпадает в осадок; сливали спирт и добавляли 600 мкл охлажденного 70⁰ С спирта и оставляли на 15 минут; спирт сливали и ставили пробы ДНК сушить. Затем в высохшие пробирки с ДНК добавляли 60 мкл бидистиллированной воды.

Метод щелочного лизиса осуществлялся по следующей схеме:1мкл лейкоцитов крови помещали в 0,5 мл пробирку, затем дабавляли 10 мкл щелочного лизисного буфера ALL. Пробы инкубировали при +60⁰ С в течение 30-45 минут. Лизат охлаждали и центрифугировали несколько секунд при 15 тыс. об/мин для осаждения конденсата. Затем добавляли 10 мкл нейтрализационного раствора NL и тщательно перемешивали. Далее центрифугировали в течение 1 минуты при 15 тыс. об/мин для осаждения

Для выделения бактериальной ДНК также использовали набор – DNA Genomic Extraction Kit фирмы "Sigma", в соответствии с прилагаемой инструкцией к набору.

Рестрикционный анализ препаратов ДНК бактерии Pasteurella multocida проводили, используя ферменты рестрикции, а именно Apa I, Ceu I, NotI.

В одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК бактерии, 7 мкл H2O, 2 мкл 10х буфера (для каждой рестриктазы использовали соответствующий ей буфер, который прилагался к набору с рестриктазами фирмы " Sigma") и 1 мкл рестриктазы (10 ед/см³ ). Смесь инкубировали при 37⁰ С в течение 2 ч и разделяли компоненты электрофорезом в 0,7 % агарозном геле.

Электрофоретический анализ рестрикционных фрагментов ДНК провордили на электрофоретическом аппарате HU 25, Scie - Plas;

Электрофорез проводили при напряжении 5 В/см, при температуре 4⁰ С в течение ночи. Для электрофореза использовали 0,7 % раствор агарозы в ТАЕ-буфере с бромистым этидием в концентрации 1 мг/см³ .

В качестве контроля использовали ДНК фага λ, обработанную рестриктазой Hind III (DNA Molecular Weight marker II (0,12-23,1 kbp). Документировали полученные результаты через трансгельиллюминатор, с помощью компьютерной программы "LabWorks 4.0", определяли молекулярные массы рестриктов, сумму всех фрагментов рестрикции.

Синтез подобранных праймеров осуществляли на синтезаторе нуклеотидов "Expedite 8909" фирмы "Applied Biosystems" согласно протоколам, прилагающимся к прибору. Полученные олигонуклеотиды элюировали с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривали в вакуумном испарителе CentriVap Concentrator,

LABCONCO. Синтезированные праймеры переосаждали этанолом, ресуспендировали в высокоочищенной воде и хранили при минус 20⁰ С. Наработку специфических участков ДНК проводили в термоциклере с градиентом температур Mastercycler gradient, Eppendorf .

Электрофорез продуктов амплификации ДНК бактерии Pasteurella multocida проводили в аппарате для горизонтального электрофореза "G-100", фирмы "Pharmacia'', при напряжении 8 В/см. Для электрофореза использовали 2 % раствор агарозы в TBE-буфере. Документирование полученных результатов проводили через трансгельиллюминатор. Последующий анализ результатов проводили с использованием программы Digi-Doc-It.

В качестве маркера молекулярных масс использовали "DNA Wide Range marker" и "DNA Ladder 1kb" фирмы "Sigma"

2.2 Результаты исследований

2.2.1 Изучение распространенности пастереллеза в Костанайской области

На территории Казахстана, согласно данным ветеринарной отчетности, имеются энзоотические вспышки пастереллеза среди крупного рогатого скота. За период с 2012 по 2015 годы в Костанайской области были подвергнуты патологоанатомическим и бактериологическим исследованиям пробы от 4357 голов павшего крупного рогатого скота, из числа которых выделено 802 культуры пастерелл (18,4%).

Таблица 2 - Информация о результатах бактериологических исследований сельскохозяйственных животных и птиц в Костанайской области за 2013 – 2015 гг.