Вывод программы из оригинала — последовательности и расчётные данные
Primer 1
Primer: 5ґ-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3ґ
Reverse: 3ґ-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5ґ
Length: 25 nt
Tm (basic): 62,0 0C
Tm (salt): 55,9 0C
Tm (NN): 59,8 0C
GC %: 24,0 %
dG: -43,5 kCal/mol
3'-tail GC %: 14,3 %
3'-tail dG: -11,2 kCal/mol
Molecular weight: 7774,1 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 3,37 µM and contains 26,2 µg ssDNA
Primer 1 self annealing:
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
||| : : :::
3'-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5'
dG: -0,68 kcal/mol
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
||| :: : : :: :::
3'-GTTTAAATTCGTCAAAGTAAAGTAA-5'
dG: -0,21 kcal/mol
Primer 1 loops:
5'-AATGAAATGAA
||| :: : A
3'-GTTTAAATTCGTC
dG: -0,09 kcal/mol
Primer 2
Primer: 5ґ-CGATAATAACGCATCGAGAAAATC-3ґ
Reverse: 3ґ-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5ґ
Length: 24 nt
Tm (basic): 66,0 0C
Tm (salt): 60,1 0C
Tm (NN): 63,0 0C
GC %: 37,5 %
dG: -44,4 kCal/mol
3'-tail GC %: 28,6 %
3'-tail dG: -10,5 kCal/mol
Molecular weight: 7424,9 g/mol
1 ml of the primer solution with an absorbance of 1 at 260
nm is 3,52 µM and contains 26,1 µg ssDNA
Primer 2 self annealing:
5'-CGATAATAACGCATCGAGAAAATC-3'
||| : :: :: : :::
3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5'
dG: 0,16 kcal/mol
Primer 2 loops:
5'-CGATAATAACGC
||| : :: A
3'-CTAAAAGAGCT
dG: 0,28 kcal/mol
Primer 1 - Primer 2 annealing:
5'-AATGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3'
:: : |||
3'-CTAAAAGAGCTACGCAATAATAGC-5'
dG: -0,21 kcal/mol
Таблица 9 - Подобранные праймеры для исследования
| Ген | Последовательность | Положение в геноме | Размер ампл.уч. п.н. |
|---|---|---|---|
| tadD | F 5`-TTCTACCCATTCTCAGCAAGGC-3` R 5`- ATCATTTCGGGCATTCACC-3` | 63-480 | 417 |
| omp87 | F 5`-AGCGAGCAACAGATAACG-3` R 5`-AGGCATGACTGTCACAAC-3` | 146-261 | 115 |
| pfhB1 | F 5`-TGAAATGAAACTGCTTAAATTTG-3` R 5`-GATAATAACGCATCGAGAAAAT-3` | 4926-5091 | 165 |
Для синтезирования праймеров была использована программа Clonemanager (http://www.scied.com/prcmpro. htm), с установкой на оптимальные параметры: температуру плавления Tmo= 58o -62o , длина 18-22 пар оснований (по), получаемый продукт 70-300 п.о. Допустимое количество праймеров-димеров – не более 4. Так же рассматривалось образование «шпильки», то есть отжиг с самим собой и повторные участки.
Помимо сходных температур плавления, по расчетным данным эти праймеры не должны образовывать стабильных гетеродуплексов друг с другом.
Фланкирующий праймерами участок ДНК был проверен с помощью программы BLAST (on-line free).
Результаты проверки показали, что нуклеотидная последовательность теоретически образуемого ПЦР-продукта соответствует Pasteurella multocida.
Смоделированные последовательности праймеров в дальнейшем были синтезированы на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems. Очистку праймеров проводили методом спиртового переосаждения. Полученные таким образом синтезированные праймеры разводили до концентрации 20 пмоль и использовали для проведения ПЦР.
2.5.2 Отработка и оптимизация параметров ПЦР
2.5.2.1 Подбор и отработка температурно-временного режима Очень важным и сложным этапом при разработке метода ПЦР является подбор и отработка параметров температуры и времени циклов амплификации.
Трем последовательным стадиям ПЦР: денатурации матрицы при нагревании, отжигу праймеров с одноцепочечной матрицей и синтезу второй цепи с помощью термостабильной ДНК-полимеразы соответствует определенный температурный профиль. Для каждой стадии экспериментальным путем подбирается температура и время. В общем случае температура этапа денатурации обычно выбирается между 90-950 С, отжига между 40-600 С, а элонгации между 70-750 С. Кольцевая ДНК умеет денатурировать после тепловой денатурации. Поэтому температура и время денатурации выбираются как компромисс между двух целей: хорошо денатурировать матрицу, не сильно повредив при этом матрицу и Taq полимеразу, которые разрушаются при нагреве.
Температура, при которой денатурируется двуспиральная ДНКматрица, зависит от содержания в ней GC оснований. При высоком содержании GC оснований, для полного расхождения цепей в молекуле ДНК необходима более высокая температура. Так же более длинные матрицы ДНК требуют большей температуры для полной денатурации. Очень низкая температура денатурации, или короткая продолжительность времени денатурации приводят к тому, что участки ДНК с высоким содержанием GC оснований не расплетутся, а денатурируют только регионы богатые АТ-основаниями. Однако более продолжительное время денатурации или более высокая температура приводят к нежелательному снижению ферментативной активности полимеразы.
Эксперимент ПЦР проводили в двух температурных режимах.
В первом эксперименте использовали амплификатор Nexus,
используя следующие режимы температур: пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 20 с, 940 С отжиг: 20 с, 520 С 30 циклов синтез: 20 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл на 12 образцов:
Таблица 10- Состав реакционной смеси с праймерами pfhB1 и tadD
