| Компонент | Объем на один образец | Объем на 12 образцов |
|---|---|---|
| KCl | 2,5 мкл | 30 мкл |
| dNTP | 2,0 мкл | 24 мкл |
| F праймер (pfhB1, tadD) | 0,9 мкл | 10,8 мкл |
| R праймер | 0,9 мкл | 10,8 мкл |
| Taq полимераза | 0,2 мкл | 2,4 мкл |
| MgCl2 | 1,5 мкл | 18 мкл |
| Деионизированная вода | 15,0 мкл | 180 мкл |
| ДНК | 2,0 мкл | 24 мкл |
Во втором эксперименте амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме: пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 20 с, 950 С отжиг: 20 с, 570 С 30 циклов синтез: 20 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
Использовали реакционную смесь в следующем составе на 25 мкл на 12 образцов:
Таблица 11 – Состав реакционной смеси с праймерами omp87, pfh
| Компонент | Объем на один образец | Объем на 12 образцов |
|---|---|---|
| KCl | 2,5 мкл | 30 мкл |
| dNTP | 0.5 мкл | 6 мкл |
| F праймер (omp87, pfh) | 0,5 мкл | 6 мкл |
| R праймер | 0,5 мкл | 6 мкл |
| Taq полимераза | 0,5 мкл | 6 мкл |
| MgCl2 | 1,0 мкл | 12 мкл |
| Деионизированная вода | 14,5 мкл | 174 мкл |
| ДНК | 5 мкл | 5 мкл |
Для амплификации использовали все 3 пары праймеров: omp87, Pfh B1 b tadD. Результаты амплификации представлены в рисунке 17.
А - Программа, где для отжига праймеров использовали температуру- 520 С.
Б - Программа, где для отжига праймеров использовали температуру - 570 С.
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.).
Из рисунка видно, что при отжиге праймеров при 520 С не получены никакие сигналы амплификации. При температуре 570 С произошел слабый отжиг праймеров PfhB1, вследствие чего нарабатывался незначительное количество ПЦР - продукта.
В следующем эксперименте попробовали увеличить температуры отжига. При температуре 580 С выход продукта начинал резко снижаться, что обусловлено превышением значения критической температуры для данных пар праймеров. Поэтому, в дальнейших экспериментах использовали температуру отжига 570 С.
При проведении следующего эксперимента учитывали важный момент: если ДНК взята в избытке, то при амплификации могут появиться неспецифические фрагменты продуктов амплификации. Поэтому, полученный нашими методами ДНК пастерелл разводили до 1000 раз. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» (Россия) при следующем режиме:
пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 30 с, 950 С отжиг: 30 с, 570 С 30 циклов синтез: 30 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
Использовали реакционную смесь следующего состава (300 мкл на 12 образцов):
Таблица 12- Состав реакционной смеси с праймерами omp 87, pfhB1, tadD
| Компонент | Объем на один образец | Объем на 12 образцов |
|---|---|---|
| KCl | 2,5 мкл | 30 мкл |
| dNTP | 0.5 мкл | 6 мкл |
| F праймер (omp87, pfh) | 0,5 мкл | 6 мкл |
| R праймер | 0,5 мкл | 6 мкл |
| Taq полимераза | 0,5 мкл | 6 мкл |
| MgCl2 | 1,0 мкл | 12 мкл |
| Деионизированная вода | 14,5 мкл | 174 мкл |
| ДНК | 5 мкл | 5 мкл |
Результаты данного эксперимента представлены на рисунке 18.
М - Маркер молекулярного веса с фрагментами ДНК известных размеров: 100, 150 и т.д пар нуклеотидов (п.н.)..
Из рисунка 18 видно, что при использовании праймера pfhB1 на дорожках 3и 4 образовались полосы, размером 165 п.н.
Для дальнейших исследований использовали праймеры на участок гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5-TGCGAGTATTACGCTACAAG-3 и Pm РfhB1 – R -5-TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3
При проведении ПЦР большое значение имеет фермент – полимераза, которая работает с комплексом элонгации (праймер и матрица ДНК). Элонгация – этап, на котором происходит основной синтез ДНК. На данный момент известно, что существует три класса
