370 п.н.
М – маркер «Direct LoadTM Wide Range Marker, 10.000 п.о. - 50 п.о.», 1- контроль (Н2О), 2,3 - ДНК штамма 90 Pasteurella multocida, 4 - ДНК Escherichia coli ; 5 - ДНК Salmonella typhimurium; 6,7 – ДНК Pasteurella multocida штамм К1 и К2; 8,9 - ДНК Pasteurella multocida из органо-тканевого материала, 10 - ДНК Salmonella Dublin, 11 - Brucella abortus, 12 - Mycobacterium bovis, 13 – ДНК Listeria monocitogenes. Рисунок 25 - Электрофореграмма продуктов амплификации при использовании праймеров Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R
Как видно из рисунка 25 только в пробах, содержащих ДНК Pasteurella multocida нарабатываются специфические продукты реакции размером около 372 п.о. (2-4, 9, 11-14). Отрицательные результаты были получены при использовании в качестве матриц ДНК Escherichia coli (4), Salmonella typhimurium (5), Listeria monocitogenes (13), Mycobacterium bovis (12), а также при использовании в качестве матриц ДНК Salmonella Dublin, Brucella abortus. Отсутствие каких-либо продуктов амплификации наблюдается и с деионизированной водой (1). Полученные результаты демонстрируют специфичность разработанного нами метода.
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР.
2.6 ПЦР тест-система для выявления ДНК
На основании результатов разработанного метода ПЦР был составлен опытный образец тест-системы для выявления пастереллеза КРС в биологическом материале, с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. Состав основных компонентов набора, необходимых для постановки реакции ПЦР: буфер для проведения реакции, специфические олигонуклеотиды (праймеры),
ДНК-полимераза, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, стерильная ПЦР-вода и контрольная ДНК.
Термостабильная ДНК полимераза (Taq DNA Polymerase) и смесь дНТФ являются коммерческими препаратами и приобретаются в готовом виде.
Объем составных компонентов реакции рассчитывался из расчета на проведение 100 тестов, т.е. анализа 100 проб, как исследуемых образцов, так и положительных и отрицательных контролей. В таблице 11 представлены комплект реагентов для проведения ПЦР по обнаружению ДНК Pasteurella multocida.
Состав10х ПЦР-буфер: 100 мM Трис HCl, pH 8,3, 15 мM MgCl2, 750 мM KCl. Данный рабочий буферный раствор был подобран при оптимизации метода ПЦР. Для приготовления буфера использовали стерильную деионизированную воду и химические реагенты высокой чистоты.
Специфические праймеры, используемые при выявлении ДНК Pasteurella multocida, были сконструированы после компьютерной обработки полного генома Pasteurella multocida программой DNASIS MAX 1.0. Подобранные праймеры синтезировали на синтезаторе олигонуклеотидов Expedite 8909 фирмы Applied Biosystems.
Раствор синтезированных праймеров предварительно высушивали на ротационном испарителе и растворяли в деионизированной воде. С целью очистки праймеры переосаждали спиртом и осадок олигонуклеотидов перерастворяли в стерильной воде до конечной концентрации 20 пмоль.
В качестве положительного контроля мы предлагаем использовать ДНК штамма 90 Pasteurella multocida. Используемую в качестве положительного контроля ДНК Pasteurella multocida получали по методике, отработанной в лаборатории и представленной в разделе материалы и методы. На конечном этапе выделения ДНК растворяли в ТЕ буфере до конечной концентрации 10 мкг/см3 .
Таблица 14 - Комплект реагентов для постановки ПЦР при выявлении ДНК Pasteurella multocida
| Наименование компонентов в наборе | Объем компонен та (мкл) | Тип упаковки | Количество пробирок (шт.) |
|---|---|---|---|
| Комплект реагентов для выделения ДНК | 500 | Пластиковый флакон объемом 50,0 см3 | 1 |
| Раствор смеси специфических праймеров Рm РfhB1- F и Рm РfhB1- R, по 20 пмоль | 100 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| Раствор смеси нуклеозидтрифосфатов (дНТФ), 10 мМ | 100 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| Раствор термостабильной ДНК полимеразы (Taq- полимераза), 5 Ед/мкл | 50 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| Раствор: неинфекционная ДНК Pasteurella multocida (положительный контроль), 10 мкг/мл | 500 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 1 |
| 10х ПЦР-буфер Стерильная ПЦР-вода | 400 800 | Пластиковая пробирка объемом 1,5 см3 | 2 5 |
Одним из компонентов, используемых при постановке реакции ПЦР, является вода, к которой предъявляются очень большие требования. Воду готовили в системе высокой очистки Milli RO и Milli Q фирмы Labconco, обеспечивающей качество воды в 16 МОм и отсутствие микроорганизмов. Деионизированную воду разливали в пробирки и автоклавировали. Все компоненты хранятся при минус 20 0С.
Прежде всего, работоспособность созданной ПЦР тест-системы была протестирована на вакцинных и вирулентных штаммах Pasteurella multocida, которыми располагает музей микроорганизмов лаборатории противобактериозной биотехнологии. Результаты одного из опытов по испытанию тест-системы для выявления ДНК Pasteurella multocida представлены на рисунке 26.
