Диагностика пастереллеза крупного рогатого скота методом ПЦР

370 п.н.

Примечание - 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 , 2 - ДНК Pasteurella multocida эпизоотический штамм; 3 – ДНК Pasteurella М 1 2 3 multocida эпизоотический штамм, М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-1000 bp".

Рисунок 26- Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК разных штаммов Pasteurella multocida методом ПЦР 370 п.н.

Результаты испытаний показали, что в пробах 1, 2, и 3 нарабатывается ПЦР-продукт размером 372 п.о., что указывает на присутствие в исследуемых пробах ДНК Pasteurella multocida. В то время как в отрицательной контрольной пробе каких-либо продуктов амплификации обнаружено не было.

Следующим шагом, разработанный опытный вариант ПЦР тестсистемы опробовали на патологическом материале. Образцы проб органов павших и вынужденно убитых телят с подозрением на пастереллез были доставлены из Илийского района Алматинской области. Из полученных органов была приготовлена 20 % суспензия, затем выделена ДНК Pasteurella multocida с использованием протеиназы К и ДСН. Проводили ПЦР используя оптимизированные условия. Результаты проведенных экспериментов представлены на рисунке 27.

М 1 2 3 4 5 6 7
370 п.о
пппп о мп о п оМ 1 2
3 370 п.н. 4 5

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 (положительный контроль) , 2-8 - 20 % суспензия органов (легкие, сердце) от павших телят из Илийского района Алматинской области от 26.07.2004 г, 9 – отрицательный контроль.

Рисунок 27 - Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК Pasteurella multocida из патологических материалов методом ПЦР

Из рисунка 27 видно, что на дорожках 2 - 8 образуются полосы, лежащие на одном уровне с положительным контролем. Данный факт позволяет заключить, что во всех исследуемых пробах методом ПЦР с последующей детекцией электрофорезом выявлено ДНК Pasteurella multocida.

Таким образом, результаты испытаний показывают, что разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных штаммов, также и из патологических материалов.

2.7 Использование метода ПЦР для обнаружения ДНК Pasteurella multocida у больных животных из неблагополучных по пастереллезу хозяйств

В июле 2012 года произошла энзоотическая вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота, принадлежащих АО «Север» Мендыкаринского района. У нескольких животных в группе проявились клинические признаки болезни: угнетение, отсутствие

аппетита, высокая температура. Из патматериала от 2 голов вынужденно забитых коров бактериологически был установлен пастереллез.

У всех животных данной группы (22 головы) была взята кровь для исследования методами ИФА и ПЦР (таблица 15). Для исследования методом ИФА использовали набор для выявления антител к пастереллезу животных фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).

Таблица 15 – результаты сравнительных исследований крови КРС

Как видно из таблицы, бактериологически был исследован материал только от 2 голов животных. При исследовании методом ИФА выявлено 9 положительных проб. При исследовании методом ПЦР - 11 положительных проб. Метод ПЦР можно применять для выявления пастереллоносителей в хозяйствах.

2.8 Разработка способа отбора и доставки патологического материала при пастереллезе крупного рогатого скота для исследования методом полимеразно-цепной реакции

Качественное взятие и доставка материала является одним из стандартизирующих и предопределяющих моментов всего лабораторного исследования. Особое значение имеет стандартизация