процесса транспортировки проб в лабораторию. Общее правило: доставить материал в лабораторию как можно быстрее. При транспортировке учитывается стабильность отдельных проб для исследований в зависимости от времени, температуры, воздействия прямого света.
Для ПЦР исследования способы доставки биологического материала разработаны в общих чертах. В методических рекомендациях «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦРдиагностики» (Москва, 2003), способ доставки носовых и ротовых истечений для исследования на пастереллез также не описан. Главным условием предложенных в рекомендации способов является свежесть, быстрота доставки материала для исследования, что не всегда бывает возможным. В Республике Казахстан методики по забору, транспортировке патологического материала для исследования методом ПЦР не разработаны. Поэтому в процессе работы перед нами стояла задача разработки способа доставки истечений из носовой и ротовой полостей для исследования методом ПЦР, который бы продлевал сроки транспортировки биоматериала.
Сущность разработанного нами способа доставки носовых и ротовых истечений заключается в следующем: в слюне и носовой слизи содержатся ферменты, выполняющие бактериолитические функции: лизоцим, протеазы, пептидазы, щелочная и кислая фосфатазы, РНКазы. Вместе с бактерией лизируется и бактериальная ДНК. Для проведения ПЦР анализа необходимо наличие нефрагментированной геномной ДНК, так как она служит матрицей для синтеза специфического продукта.
Истечения для исследования брали стерильными ватными тампонами и помещаются в стерильную одноразовую пробирку с 0,9% физиологическим раствором. Пробирки с пробами истечений выдерживаются в кипящей водяной бане в течение 10 минут, в результате чего разрушаются ферменты слюны и носовой слизи, тем самым устраняется их лизирующее действие, также лизируются бактериальные клетки и выделяется ДНК. Затем в пробирки добавляется 96% этиловый спирт в соотношении 1 : 4. Выделенная ДНК консервируется этиловым спиртом, что продлевает срок доставки истечений для исследования на пастереллез до 24 часов. Преимущество данного способа заключается в том, что увеличивается срок доставки материала для исследования до 24 часов при комнатной температуре.
При исследовании крови и носовых и ротовых истечений доставленных от больных животных п. Прогресс, с/о Айдарлы, п. Челгаши Карасуского района в года не удавалось выделить
качественную ДНК, так как из-за дальности расстояния пробы материала доставлялись в течение 8 -12 часов.
В КХ «Дастан» с/о Тастинский Амангельдинского района произошла вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота. В хозяйстве пали 2 коровы, у 8 голов крупного ргатого скота наблюдались клинические признаки болезни. В лабораторию через 12 часов было доставлено для исследования методом ПЦР 10 проб крови, консервированных 3% раствором ЭДТА, кусочки органов от павших коров в термочемоданах и 5 проб истечений из ротовой и носовой полостей, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4 (рисунок 28).
Примечание – 1 – 5 дорожки – ДНК носовых истечений, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4; 6 - ДНК крови, консервированной 3% раствором ЭДТА; 7 – ДНК из органов, доставленных в термочемоданах.
Рисунок 28 – Электрофореграмма проб материала из КХ «Дастан» доставленных через 12 часов
Как видно на фореграмме при проведении электорофореза выделенных ДНК органов, доставленных в неконсервированном виде в термочемоданах и консервированной крови не удавалось выделить качественную ДНК, если с момента взятия пробы проходило больше 10 часов. Электрофореграммы показывали лишь шмеры.
В процессе экспериментов нами проводилось выделение ДНК из проб истечений доставленных из хозяйств «Викторовское» Тарановского района, ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского
района, п. Челгаши Карасуского района в разные промежутки времени: через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 часов (рисунок 25).
Как видно на рисунке 27, через 3 часа после взятия материала ДНК выделяется из всех проб истечений: доставленных в стерильных пробирках с без консервантов, в термочемоданах без консервантов и подготовленных к доставке по нашей методике. Через 6 часов из проб истечений, доставленных без консерванта выделяется около 50% ДНК. Из проб истечений доставленых в термочемоданах без консервантов через 6 часов выделяется около 70% ДНК. Из проб истечений, подготовленных к доставке по нашей методике ДНК выделяется в количествах достаточных для проведения генотипических исследований до 24 часов.
%
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3 6 9 12 15 18 21 24 27 часы
кипячение
в термочемоданах
без консервации
Рисунок 29 - Выход ДНК при различных способах доставки
проб истечений
Таким образом, нами разработан оптимальный способ доставки носовых и ротовых истечений для исследования методом ПЦР при пастереллезе крупного рогатого скота, заключающийся в кратковременном кипячении в течение 10 минут на водяной бане проб истечений, в результате чего лизируются ферменты слюны и носовой слизи и выделяется ДНК, которая консервируется добавлением 96% этилового спирта в соотношении 1 : 4, что продлевает срок доставки истечений для исследования на пастереллез до 24 часов.
