3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Анализ данных литературы показал, что пастереллезная инфекция имеет широкое распространение во многих странах, в том числе и в Республике Казахстан. На территории Казахстана, согласно данным ветеринарной отчетности, имеются энзоотические вспышки пастереллеза среди крупного рогатого скота, лошадей, свиней, птиц.
К пастереллезу восприимчивы крупный рогатый скот, лошади, мелкий рогатый скот, буйволы, козы, свиньи, грызуны, кошки, собаки, дикие животные, домашние и дикие птицы.
Диагноз пастереллеза ставится комплексно, с учетом данных эпизоотологии, клиники, данных патологоанатомических изменений и бактериологического исследования. Каждый из методов диагностики имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в особенности с результатами патологоморфологических и лабораторных исследований.
Совокупность сведений по эпизоотологии, клинической и патологоанатомической картине дает право на постановку предварительного диагноза, результаты же бактериологических и биологических исследований позволяют поставить диагноз окончательно.
Серологический диагноз при пастереллезе имеет меньшее значение, чем такие методы диагностики, как бактериологический и биологический, так как болезнь протекает быстро. Но с целью своевременного и более полного выявления и в неблагополучных и в благополучных хозяйствах скрытых больных и животныхпастереллоносителей применение серологических реакций имеет немалое значение.
На сегодняшний день наиболее часто используемым диагностическим методом для диагностики пастереллеза является ИФАдиагностика. В настоящее время в России и Казахстане для исследований на пастереллез животных используется набор для выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida) иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция). Являясь косвенным методом, ИФА определяет лишь белки-маркеры - продукты жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции.
В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), ПЦРдиагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Высокая чувствительность метода позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или
вирусов. К преимуществам метода можно отнести высокую скорость получения результата анализа и возможность диагностики острых, вялотекущих и скрытых инфекций.
Результаты исследований, проведенные учеными разных стран, также показывают, что молекулярные методы выявления и типирования Pasteurella multocida превосходят обычные методы в случае необходимости быстрых эпизоотологических исследований геморрагической септицемии и могут использоваться в эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга.
Современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез, генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная картография, очень увеличили понимание Pasteurella multocida, и предоставили исследователям много молекулярных инструментов для изучения патогенеза и эпизоотологии данного возбудителя на молекулярном уровне.
Из вышеизложенных данных можно заключить, что для диагностики бактериальных инфекций в зарубежных странах внедряется метод ПЦР и его различные модификации. Поэтому разработка, адаптирование и внедрение в ветеринарную практику в РК тест-системы (праймера) для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота на основе ПЦР – требование сегодняшнего дня.
В Костанайской области случаются вспышки пастереллеза животных и птицы. За период с 2012 по 2015 гг. в области выделение культур Pasteurella multocida из патматериала от крупного рогатого скота начиная с 2013 года растет: в 2013г 5,8%, в 2014 г - 8,3%, в 2015г - 12,5%. Наибольший процент выделения культур за анализируемый период наблюдается у свиней – 15,5%, крупного рогатого скота – 7,3% и птицы – 6,7%.
Были изучены основные биологиеские свойства пастерелл: полиморфизм, отрицательная окраска по Граму, выраженная биполярность при окрашивании по Романовскому-Гимзе, наличие капсулы при окраске по Михину, рост в аэробных условиях на обычных питательных средах, но лучше с добавлением сыворотки лошади, образование на плотных питательных средах гладких S-форм колоний с радужным свечением в косопроходящем свете, рост на МПБ, бульоне Хоттингера сопровождающиеся помутнением среды с последующим просветлением с образованием слизистого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде косички, способность образовывать индол и сероводород, не способность гемолизировать эритроциты, вариабельность биохимических свойств. Производственные и
эпизоотические штаммы пастерелл обладают вирулентными и антигенными свойствами.
Результаты качественного и количественного анализа препаратов ДНК показали, что наилучшим является метод с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.
По результатам рестрикционного анализа среднее значение размера ДНК штамма 90 Pasteurella multocida составило 2.353 kb. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом.
В наших экспериментах для дизайна праймеров была использована последовательность гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5TGCGAGTATTACGCTACAAG-3 и Pm РfhB1 – R -5TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3 Pasteurella multocida.
Были сконструированы и синтезированы специфические праймеры на участки генов pfhB1.
Были определены временные и температурные условия амплификации, проводили оптимизацию содержания компонентов в реакционной смеси и отработку ПЦР.
На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР: пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 30 с, 950 С отжиг: 30 с, 570 С 30 циклов синтез: 30 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
Были отработаны оптимальные условия проведения ПЦР по составу солевого буфера ( концентрация MgCl2 и KCl, рН буфера), оптимизирована концентрация Taq ДНК-полимеразы, добавочных компонентов буфера.
Порог чувствительности метода ПЦР с различными модификациями для выявления ДНК Pasteurella multocida составил 0,5 пг в пробе и сокращение времени постановки диагноза (20 сек.) - повышают диагностическую ценность отработанного метода. Полученные нами данные показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР. Результаты испытаний показали, что разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных штаммов, также и из патологических материалов.
