ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Своевременная и точная диагностика инфекции является одним из основных факторов в недопущении ее распространения, что позволяет предотвращать и существенно снижать экономические потери. Для лабораторной диагностики и идентификации пастереллеза на сегодняшний день разработаны и применяются различные культуральные, серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность. В связи с молниеносным течением инфекции вопросы прижизненной диагностики пастереллеза до настоящего времени остаются нерешенными. Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики, остается актуальной проблемой и до настоящего времени

В контексте поставленных задач полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет многократного копирования участков специфических последовательностей ДНК. Прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа сделали метод ПЦР незамениным. В связи с этим, нами были проведены исследования по разработке метода ПЦР для детекции ДНК Pasteurella multocida, а так же изучена эффективность разработанного метода для диагностики болезни.

1 Для разработки ПЦР необходимо наличие нативных и высокоочищенных полноразмерных нефрагментированных препаратов геномной ДНК Pasteurella multocida во избежание получения недостоверных результатов. Поэтому необходимо было отработать схему выделения, позволяющую получить высокоочищенные препараты ДНК. В экспериментах по выделению ДНК Pasteurella multocida использовали выделенные эпизоотические штаммы и музейные штаммы Pasteurella multocida. Существует множество методов для выделения нуклеиновой кислоты бактерий. Нами для выделения бактериальной ДНК были испытаны методы с использованием додецилсульфата натрия (ДСН) в комплексе с протеиназой К, а также детергента Nonidet P-40 и Тween 20 с последующей фенольной депротеинизацией. Лучшие результаты при выделении ДНК из бактерий Pasteurella multocida достигались при обработке суспензии детергентом – 10 % ДСН в сочетании с протеиназой К, с последующей экстракцией

фенол/хлороформом. Отношение оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК Pasteurella multocida имело средние значение 1,94  0,04 (n=5). Данный метод обеспечивал более высокий выход нативной нуклеиновой кислоты до 80 %.

2 Проведенный реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida позволил показать, что размер геномной ДНК штамма Pasteurella multocida 90, составляет 2,353  8 п.о. Результаты наших исследований согласуются с данными литературы.

3 Основным этапом при разработке ПЦР является разработка праймеров для детекции, в нашем случае, ДНК Pasteurella multocida.

Правильный подбор пар праймеров является одним из основных факторов, влияющих на специфичность реакции. Для конструирования и компьютерного моделирования олигонуклеотидов был проведен поиск и отбор нуклеотидной последовательности отдельных генов генома Pasteurella multocida. Поиск проводили на сайте NCBI с базой данных GenBank, Результаты поиска показали, что в Genbank депонирована одна полная нуклеотидная последовательность генома Pasteurella multocida ( NC006623 ) и множество отдельных генов.

С использованием компьютерных программ были определены наиболее консерватиные и вариабельные участки гена pfhB1, которые были использованы для подбора праймеров. Для наибольшей специфичности праймерам учитывали все критерии, предъявляемые к олигонуклеотидам для ПЦР. В результате компьютерного анализа было сгенерировано 21 пара праймеров, которые в дальнейшем проходили апробацию. Была отобрана пара праймеров для проведения ПЦР, которые были названы Рm pfhB1- F (прямой) и Рm pfhB1- R(обратный), а продукт амплификации составлял 372 п.о.

4 В результате проведенных экспериментальных работ по подбору оптимальных температурно-временных параметров амплификации и определению состава реакционной ПЦР смеси были определены2,353  8 (n=5) п.о условия постановки ПЦР, при которых происходит специфическая наработка ПЦР продукта размером 372 п.о. и в достаточном количестве. На основании полученных данных можно заключить, что для наработки специфического продукта достаточно 0.05 ед. активности фермента в реакционной смеси. Концентрация магния существено не влияет на процесс амплификации. Так же не оказывают существенного положительного эффекта на специфичность и добавочные компоненты. только буферные растворы следующего состава (6-100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl,7- 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМ MgCl2, 250 мМ KCl и 9 - 100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl) приводят к ингибированию реакции. Суммируя все вышеизложенные результаты по оптимизации компонетов, мы использовали реакционную смесь следующего состава:

(50 мкл): х10 ПЦР буфер (100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP (10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,05 ед Taq-полимеразы в конечной концентрации.

Результаты по подбору и оптимизации температурновременного режима показали, что в пределах температур от 52,5 до 59,5 0С специфический ПЦР-продукт нарабатывается в достаточных количествах, отсутствуют шлейфы. Полимеразе для наработки ПЦРпродукта размером 372 п.о. в нашем случае достаточно 20 с. Обобщая все температурно-временные характеристики, при проведении ПЦР использовали следующие условия: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С

пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использование данного режима существенно сокращает время постановки диагноза при сравнении температурно-временных профилей, приводимых в литературе. Данное обстоятельство повышает диагностическую ценность разработанного метода по обнаружению ДНК Pasteurella multocida.

5 Проведенные эксперименты по определению специфичности метода ПЦР с праймерами Рm 16SRNA- F , Рm 16SRNA- R показали образование ПЦР продукта, характерного только для Pasteurella multocida. Разработанный метод позволяет выявлять ДНК бактерий в концентрации 0,5 пг в исследуемой пробе. Порог чувствительности метода ПЦР с различными модификациями по обнаружению ДНК Pasteurella multocida по данным литературы изменяется в пределах 50 пг–50 фг . Результаты наших исследований по чувствительности не уступают зарубежным аналогичным работам.

6 Разработанный лабораторный вариант тест-системы для обнаружения ДНК Pasteurella multocida был апробирован на штаммах Pasteurella multocida, хранящихся в музее микроорганизмов лаборатории противобактериозной биотехнологии; биологических (кровь, смывы из ротовой и носовой полостей) патологических материалах от павших животных, доставленных из хозяйств. Нарабатывался специфический продукт только в тех пробах, которые содержали ДНК Pasteurella multocida. Разработанная ПЦР тест-система для обнаружения ДНК Pasteurella multocida в пробах органов павших и больных животных может быть использована для диагностики болезни.