Диагностика пастереллеза крупного рогатого скота методом ПЦР

М 1 2 3 4 5 6 7
370 п.о
пппп о мп о п оМ 1 2
3 370 п.н. 4 5

Примечание - М – маркер ДНК "Amplisize Molecular Ruler 50-2000 bp", 1 – ДНК Pasteurella multocida штамм 90 (положительный контроль) , 2-8 - 20 % суспензия органов (легкие, сердце) от павших телят из Илийского района Алматинской области от 26.07.2004 г, 9 – отрицательный контроль.

Рисунок 27 - Электрофоретический профиль разделения ПЦР продуктов при апробации тест-системы по выявлению ДНК Pasteurella multocida из патологических материалов методом ПЦР

Из рисунка 27 видно, что на дорожках 2 - 8 образуются полосы, лежащие на одном уровне с положительным контролем. Данный факт позволяет заключить, что во всех исследуемых пробах методом ПЦР с последующей детекцией электрофорезом выявлено ДНК Pasteurella multocida.

Таким образом, результаты испытаний показывают, что разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных штаммов, также и из патологических материалов.

2.7 Использование метода ПЦР для обнаружения ДНК Pasteurella multocida у больных животных из неблагополучных по пастереллезу хозяйств

В июле 2012 года произошла энзоотическая вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота, принадлежащих АО «Север» Мендыкаринского района. У нескольких животных в группе проявились клинические признаки болезни: угнетение, отсутствие

аппетита, высокая температура. Из патматериала от 2 голов вынужденно забитых коров бактериологически был установлен пастереллез.

У всех животных данной группы (22 головы) была взята кровь для исследования методами ИФА и ПЦР (таблица 15). Для исследования методом ИФА использовали набор для выявления антител к пастереллезу животных фирмы «Synbiotics Europe» (Франция).

Таблица 15 – результаты сравнительных исследований крови КРС

Как видно из таблицы, бактериологически был исследован материал только от 2 голов животных. При исследовании методом ИФА выявлено 9 положительных проб. При исследовании методом ПЦР - 11 положительных проб. Метод ПЦР можно применять для выявления пастереллоносителей в хозяйствах.

2.8 Разработка способа отбора и доставки патологического материала при пастереллезе крупного рогатого скота для исследования методом полимеразно-цепной реакции

Качественное взятие и доставка материала является одним из стандартизирующих и предопределяющих моментов всего лабораторного исследования. Особое значение имеет стандартизация

процесса транспортировки проб в лабораторию. Общее правило: доставить материал в лабораторию как можно быстрее. При транспортировке учитывается стабильность отдельных проб для исследований в зависимости от времени, температуры, воздействия прямого света.

Для ПЦР исследования способы доставки биологического материала разработаны в общих чертах. В методических рекомендациях «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦРдиагностики» (Москва, 2003), способ доставки носовых и ротовых истечений для исследования на пастереллез также не описан. Главным условием предложенных в рекомендации способов является свежесть, быстрота доставки материала для исследования, что не всегда бывает возможным. В Республике Казахстан методики по забору, транспортировке патологического материала для исследования методом ПЦР не разработаны. Поэтому в процессе работы перед нами стояла задача разработки способа доставки истечений из носовой и ротовой полостей для исследования методом ПЦР, который бы продлевал сроки транспортировки биоматериала.

Сущность разработанного нами способа доставки носовых и ротовых истечений заключается в следующем: в слюне и носовой слизи содержатся ферменты, выполняющие бактериолитические функции: лизоцим, протеазы, пептидазы, щелочная и кислая фосфатазы, РНКазы. Вместе с бактерией лизируется и бактериальная ДНК. Для проведения ПЦР анализа необходимо наличие нефрагментированной геномной ДНК, так как она служит матрицей для синтеза специфического продукта.

Истечения для исследования брали стерильными ватными тампонами и помещаются в стерильную одноразовую пробирку с 0,9% физиологическим раствором. Пробирки с пробами истечений выдерживаются в кипящей водяной бане в течение 10 минут, в результате чего разрушаются ферменты слюны и носовой слизи, тем самым устраняется их лизирующее действие, также лизируются бактериальные клетки и выделяется ДНК. Затем в пробирки добавляется 96% этиловый спирт в соотношении 1 : 4. Выделенная ДНК консервируется этиловым спиртом, что продлевает срок доставки истечений для исследования на пастереллез до 24 часов. Преимущество данного способа заключается в том, что увеличивается срок доставки материала для исследования до 24 часов при комнатной температуре.

При исследовании крови и носовых и ротовых истечений доставленных от больных животных п. Прогресс, с/о Айдарлы, п. Челгаши Карасуского района в года не удавалось выделить