качественную ДНК, так как из-за дальности расстояния пробы материала доставлялись в течение 8 -12 часов.
В КХ «Дастан» с/о Тастинский Амангельдинского района произошла вспышка пастереллеза среди крупного рогатого скота. В хозяйстве пали 2 коровы, у 8 голов крупного ргатого скота наблюдались клинические признаки болезни. В лабораторию через 12 часов было доставлено для исследования методом ПЦР 10 проб крови, консервированных 3% раствором ЭДТА, кусочки органов от павших коров в термочемоданах и 5 проб истечений из ротовой и носовой полостей, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4 (рисунок 28).
Примечание – 1 – 5 дорожки – ДНК носовых истечений, выдержанных на кипящей водяной бане в течение 10 минут и консервированных 96% этиловым спиртом в соотношении 1:4; 6 - ДНК крови, консервированной 3% раствором ЭДТА; 7 – ДНК из органов, доставленных в термочемоданах.
Рисунок 28 – Электрофореграмма проб материала из КХ «Дастан» доставленных через 12 часов
Как видно на фореграмме при проведении электорофореза выделенных ДНК органов, доставленных в неконсервированном виде в термочемоданах и консервированной крови не удавалось выделить качественную ДНК, если с момента взятия пробы проходило больше 10 часов. Электрофореграммы показывали лишь шмеры.
В процессе экспериментов нами проводилось выделение ДНК из проб истечений доставленных из хозяйств «Викторовское» Тарановского района, ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского
района, п. Челгаши Карасуского района в разные промежутки времени: через 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 часов (рисунок 25).
Как видно на рисунке 27, через 3 часа после взятия материала ДНК выделяется из всех проб истечений: доставленных в стерильных пробирках с без консервантов, в термочемоданах без консервантов и подготовленных к доставке по нашей методике. Через 6 часов из проб истечений, доставленных без консерванта выделяется около 50% ДНК. Из проб истечений доставленых в термочемоданах без консервантов через 6 часов выделяется около 70% ДНК. Из проб истечений, подготовленных к доставке по нашей методике ДНК выделяется в количествах достаточных для проведения генотипических исследований до 24 часов.
%
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3 6 9 12 15 18 21 24 27 часы
кипячение
в термочемоданах
без консервации
Рисунок 29 - Выход ДНК при различных способах доставки
проб истечений
Таким образом, нами разработан оптимальный способ доставки носовых и ротовых истечений для исследования методом ПЦР при пастереллезе крупного рогатого скота, заключающийся в кратковременном кипячении в течение 10 минут на водяной бане проб истечений, в результате чего лизируются ферменты слюны и носовой слизи и выделяется ДНК, которая консервируется добавлением 96% этилового спирта в соотношении 1 : 4, что продлевает срок доставки истечений для исследования на пастереллез до 24 часов.
3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Анализ данных литературы показал, что пастереллезная инфекция имеет широкое распространение во многих странах, в том числе и в Республике Казахстан. На территории Казахстана, согласно данным ветеринарной отчетности, имеются энзоотические вспышки пастереллеза среди крупного рогатого скота, лошадей, свиней, птиц.
К пастереллезу восприимчивы крупный рогатый скот, лошади, мелкий рогатый скот, буйволы, козы, свиньи, грызуны, кошки, собаки, дикие животные, домашние и дикие птицы.
Диагноз пастереллеза ставится комплексно, с учетом данных эпизоотологии, клиники, данных патологоанатомических изменений и бактериологического исследования. Каждый из методов диагностики имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в особенности с результатами патологоморфологических и лабораторных исследований.
Совокупность сведений по эпизоотологии, клинической и патологоанатомической картине дает право на постановку предварительного диагноза, результаты же бактериологических и биологических исследований позволяют поставить диагноз окончательно.
Серологический диагноз при пастереллезе имеет меньшее значение, чем такие методы диагностики, как бактериологический и биологический, так как болезнь протекает быстро. Но с целью своевременного и более полного выявления и в неблагополучных и в благополучных хозяйствах скрытых больных и животныхпастереллоносителей применение серологических реакций имеет немалое значение.
На сегодняшний день наиболее часто используемым диагностическим методом для диагностики пастереллеза является ИФАдиагностика. В настоящее время в России и Казахстане для исследований на пастереллез животных используется набор для выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida) иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция). Являясь косвенным методом, ИФА определяет лишь белки-маркеры - продукты жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции.
В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), ПЦРдиагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Высокая чувствительность метода позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или
