вирусов. К преимуществам метода можно отнести высокую скорость получения результата анализа и возможность диагностики острых, вялотекущих и скрытых инфекций.
Результаты исследований, проведенные учеными разных стран, также показывают, что молекулярные методы выявления и типирования Pasteurella multocida превосходят обычные методы в случае необходимости быстрых эпизоотологических исследований геморрагической септицемии и могут использоваться в эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга.
Современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез, генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная картография, очень увеличили понимание Pasteurella multocida, и предоставили исследователям много молекулярных инструментов для изучения патогенеза и эпизоотологии данного возбудителя на молекулярном уровне.
Из вышеизложенных данных можно заключить, что для диагностики бактериальных инфекций в зарубежных странах внедряется метод ПЦР и его различные модификации. Поэтому разработка, адаптирование и внедрение в ветеринарную практику в РК тест-системы (праймера) для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота на основе ПЦР – требование сегодняшнего дня.
В Костанайской области случаются вспышки пастереллеза животных и птицы. За период с 2012 по 2015 гг. в области выделение культур Pasteurella multocida из патматериала от крупного рогатого скота начиная с 2013 года растет: в 2013г 5,8%, в 2014 г - 8,3%, в 2015г - 12,5%. Наибольший процент выделения культур за анализируемый период наблюдается у свиней – 15,5%, крупного рогатого скота – 7,3% и птицы – 6,7%.
Были изучены основные биологиеские свойства пастерелл: полиморфизм, отрицательная окраска по Граму, выраженная биполярность при окрашивании по Романовскому-Гимзе, наличие капсулы при окраске по Михину, рост в аэробных условиях на обычных питательных средах, но лучше с добавлением сыворотки лошади, образование на плотных питательных средах гладких S-форм колоний с радужным свечением в косопроходящем свете, рост на МПБ, бульоне Хоттингера сопровождающиеся помутнением среды с последующим просветлением с образованием слизистого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде косички, способность образовывать индол и сероводород, не способность гемолизировать эритроциты, вариабельность биохимических свойств. Производственные и
эпизоотические штаммы пастерелл обладают вирулентными и антигенными свойствами.
Результаты качественного и количественного анализа препаратов ДНК показали, что наилучшим является метод с использованием додецилсульфата натрия и протеиназы К.
По результатам рестрикционного анализа среднее значение размера ДНК штамма 90 Pasteurella multocida составило 2.353 kb. Полученные данные в дальнейшем можно использовать для дифференциации штаммов на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом.
В наших экспериментах для дизайна праймеров была использована последовательность гена pfhB1: Pm РfhB1 -F - 5TGCGAGTATTACGCTACAAG-3 и Pm РfhB1 – R -5TGAACGTCGCTCTGTATAAC-3 Pasteurella multocida.
Были сконструированы и синтезированы специфические праймеры на участки генов pfhB1.
Были определены временные и температурные условия амплификации, проводили оптимизацию содержания компонентов в реакционной смеси и отработку ПЦР.
На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР: пре-денатурация: 5 мин, 950 С денатурация: 30 с, 950 С отжиг: 30 с, 570 С 30 циклов синтез: 30 с, 720 С пост-репликация 5 мин, 720 С
Были отработаны оптимальные условия проведения ПЦР по составу солевого буфера ( концентрация MgCl2 и KCl, рН буфера), оптимизирована концентрация Taq ДНК-полимеразы, добавочных компонентов буфера.
Порог чувствительности метода ПЦР с различными модификациями для выявления ДНК Pasteurella multocida составил 0,5 пг в пробе и сокращение времени постановки диагноза (20 сек.) - повышают диагностическую ценность отработанного метода. Полученные нами данные показывают высокую специфичность разработанного метода ПЦР. Результаты испытаний показали, что разработанный лабораторный образец ПЦР тест-системы позволяет выявлять ДНК Pasteurella multocida, выделенную из различных штаммов, также и из патологических материалов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Своевременная и точная диагностика инфекции является одним из основных факторов в недопущении ее распространения, что позволяет предотвращать и существенно снижать экономические потери. Для лабораторной диагностики и идентификации пастереллеза на сегодняшний день разработаны и применяются различные культуральные, серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность. В связи с молниеносным течением инфекции вопросы прижизненной диагностики пастереллеза до настоящего времени остаются нерешенными. Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов лабораторной диагностики, остается актуальной проблемой и до настоящего времени
В контексте поставленных задач полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет многократного копирования участков специфических последовательностей ДНК. Прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа сделали метод ПЦР незамениным. В связи с этим, нами были проведены исследования по разработке метода ПЦР для детекции ДНК Pasteurella multocida, а так же изучена эффективность разработанного метода для диагностики болезни.
1 Для разработки ПЦР необходимо наличие нативных и высокоочищенных полноразмерных нефрагментированных препаратов геномной ДНК Pasteurella multocida во избежание получения недостоверных результатов. Поэтому необходимо было отработать схему выделения, позволяющую получить высокоочищенные препараты ДНК. В экспериментах по выделению ДНК Pasteurella multocida использовали выделенные эпизоотические штаммы и музейные штаммы Pasteurella multocida. Существует множество методов для выделения нуклеиновой кислоты бактерий. Нами для выделения бактериальной ДНК были испытаны методы с использованием додецилсульфата натрия (ДСН) в комплексе с протеиназой К, а также детергента Nonidet P-40 и Тween 20 с последующей фенольной депротеинизацией. Лучшие результаты при выделении ДНК из бактерий Pasteurella multocida достигались при обработке суспензии детергентом – 10 % ДСН в сочетании с протеиназой К, с последующей экстракцией
