фенол/хлороформом. Отношение оптической плотности (Е260/Е280) полученных препаратов ДНК Pasteurella multocida имело средние значение 1,94  0,04 (n=5). Данный метод обеспечивал более высокий выход нативной нуклеиновой кислоты до 80 %.

2 Проведенный реcтрикционный анализ ДНК Pasteurella multocida позволил показать, что размер геномной ДНК штамма Pasteurella multocida 90, составляет 2,353  8 п.о. Результаты наших исследований согласуются с данными литературы.

3 Основным этапом при разработке ПЦР является разработка праймеров для детекции, в нашем случае, ДНК Pasteurella multocida.

Правильный подбор пар праймеров является одним из основных факторов, влияющих на специфичность реакции. Для конструирования и компьютерного моделирования олигонуклеотидов был проведен поиск и отбор нуклеотидной последовательности отдельных генов генома Pasteurella multocida. Поиск проводили на сайте NCBI с базой данных GenBank, Результаты поиска показали, что в Genbank депонирована одна полная нуклеотидная последовательность генома Pasteurella multocida ( NC006623 ) и множество отдельных генов.

С использованием компьютерных программ были определены наиболее консерватиные и вариабельные участки гена pfhB1, которые были использованы для подбора праймеров. Для наибольшей специфичности праймерам учитывали все критерии, предъявляемые к олигонуклеотидам для ПЦР. В результате компьютерного анализа было сгенерировано 21 пара праймеров, которые в дальнейшем проходили апробацию. Была отобрана пара праймеров для проведения ПЦР, которые были названы Рm pfhB1- F (прямой) и Рm pfhB1- R(обратный), а продукт амплификации составлял 372 п.о.

4 В результате проведенных экспериментальных работ по подбору оптимальных температурно-временных параметров амплификации и определению состава реакционной ПЦР смеси были определены2,353  8 (n=5) п.о условия постановки ПЦР, при которых происходит специфическая наработка ПЦР продукта размером 372 п.о. и в достаточном количестве. На основании полученных данных можно заключить, что для наработки специфического продукта достаточно 0.05 ед. активности фермента в реакционной смеси. Концентрация магния существено не влияет на процесс амплификации. Так же не оказывают существенного положительного эффекта на специфичность и добавочные компоненты. только буферные растворы следующего состава (6-100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl,7- 100 мМ Трис HCl, pH 8,8, 35 мМ MgCl2, 250 мМ KCl и 9 - 100 мМ Трис HCl, pH 9,2, 15 мМ MgCl2, 250 мМ KCl) приводят к ингибированию реакции. Суммируя все вышеизложенные результаты по оптимизации компонетов, мы использовали реакционную смесь следующего состава:

(50 мкл): х10 ПЦР буфер (100 мМ Трис HCl, pH 8,3, 15 мМ MgCl2, 750 мМ KCl) 10 мкл, 1 мкл dNTP (10 мМ), по 1 мкл праймеров (20 пмоль каждый), 0,05 ед Taq-полимеразы в конечной концентрации.

Результаты по подбору и оптимизации температурновременного режима показали, что в пределах температур от 52,5 до 59,5 0С специфический ПЦР-продукт нарабатывается в достаточных количествах, отсутствуют шлейфы. Полимеразе для наработки ПЦРпродукта размером 372 п.о. в нашем случае достаточно 20 с. Обобщая все температурно-временные характеристики, при проведении ПЦР использовали следующие условия: пре-денатурация: 5 мин, 95⁰ С денатурация: 30 с, 95⁰ С отжиг: 30 с, 57⁰ С 30 циклов синтез: 30 с, 72⁰ С

пост-репликация 5 мин, 72⁰ С

Использование данного режима существенно сокращает время постановки диагноза при сравнении температурно-временных профилей, приводимых в литературе. Данное обстоятельство повышает диагностическую ценность разработанного метода по обнаружению ДНК Pasteurella multocida.

5 Проведенные эксперименты по определению специфичности метода ПЦР с праймерами Рm 16SRNA- F , Рm 16SRNA- R показали образование ПЦР продукта, характерного только для Pasteurella multocida. Разработанный метод позволяет выявлять ДНК бактерий в концентрации 0,5 пг в исследуемой пробе. Порог чувствительности метода ПЦР с различными модификациями по обнаружению ДНК Pasteurella multocida по данным литературы изменяется в пределах 50 пг–50 фг . Результаты наших исследований по чувствительности не уступают зарубежным аналогичным работам.

6 Разработанный лабораторный вариант тест-системы для обнаружения ДНК Pasteurella multocida был апробирован на штаммах Pasteurella multocida, хранящихся в музее микроорганизмов лаборатории противобактериозной биотехнологии; биологических (кровь, смывы из ротовой и носовой полостей) патологических материалах от павших животных, доставленных из хозяйств. Нарабатывался специфический продукт только в тех пробах, которые содержали ДНК Pasteurella multocida. Разработанная ПЦР тест-система для обнаружения ДНК Pasteurella multocida в пробах органов павших и больных животных может быть использована для диагностики болезни.

Список использованной литературы

1 Watt J.M., Swiatlo E., Wade M.M., Champlin F.R. Regulation of capsule biosynthesis in serotype A strains of Pasteurella multocida// Microbiol Lett. -2003.- V. 8. – Р. 9-14.

2 Ewers C., Lübke-Becker A., Bethe A., Kiebling S., Filter M., Wieler L.H. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status//Vet Microbiol. –2006. - v.7. - Р. 3- 4.

3 Шегидевич Э.А., Федотов В.Б., Крючков В.Я. Серотиповой состав Пастерелла мультоцида // Труды ВИЭВ. – М., 1983. – Т. 38. – С.15-19.

4 Масимов К.А. Значение пастерелл (Р.multocida) при остром респираторном синдроме парагриппа-3 у телят в откормочных хозяйствах промышленного типа: автореф. ...канд.дисс. – М., 1982. – 29 с.

5 Gautam R., Kumar A.A., Singh V.P., Singh V.P., Dutta T.K., Shivachandra SB. Specific identification of Pasteurella multocida serogroup-A isolates by PCR assay// Res Vet Sci.- 2004. - v.3. –Р.179-85.

6 Масимов Н.А. Пастереллез животных: Лекция // Моск. Гос. Акад. вет. медицины и биотехнологии им.К.И.Скрябина. – М., 1995. – 12с.

7 Сосов Р.Ф. Пастереллез // Эпизоотология. - М.:Колос, 1974. - С.4-5.

8 Rapports. de L^| Office Inretnational des Episooties Sessin generale de mai,1979,С. 12-14.

9 Джупина С.И., Колосов А.А. Особенности эпизоотологии, клинического проявления и диагностики пастереллеза в Новосибирской области // Профилактики и лечение болезней крупного рогатого скота. - 1992. - № 24. - С.15-22.

10 Салимов В.А., Жаров А.В. // Ветеринария. - 2007.-№ 6. – С. 14 - 15.

11 Намет А.М. Иммунопрофилактика пастереллеза лошадей: автореф. докт. вет. наук. –Алматы, 2006. –3 с.

12 Кожаев А.Н. Поливалентная вакцина против пастереллеза сельскохозяйственных животных: автореф. … канд. вет. наук. –Алматы, 2008. –3 с.

13 Борисенкова А.Н. Рекомендации по диагностике, профилактике и мерам борьбы с пастереллезом птиц: технологические процессы // Госагропром СССР. ВНИВИП. - Л., 1986. - 25 с.

14 Пустовит Г.Л., Федотов Н.И., Кучеренко Л.А. Некоторые особенности эпизоотологии и течения пастереллеза свиней // В кн.: Инфекционные и инвазионные болезни с.-х. животных и птиц. – Одесса, 1983. – С.15-18.