комплексный аллерген (КAM) из атипичных микобактерий (А.H. Шаров, 1978).
E.B. Смирнов и др. (1970), А.А. Солонеко (1977) изучали показатель повреждения нейтрофилов (ППН) и установили, что у животных, зараженных атипичными микобактериями, ППН отрицательный, а у зараженных микобактериями туберкулеза - положительный.
А.Л. Шабад и др. (1963), А.И. Кузин (1966), А.С. Латышев (1968), И.А. Измайлов и др. (1968), А.С. Донченко и др. (1971), И.Т. Нечваль и др. (1973) считают возможным дифференцировать неспецифические реакции на туберкулин внутривенной туберкулиновой пробой. Lutsevich (1976), Merkal (1977) предлагают для этой цели реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ).
При наличии неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота в постановке правильного диагноза и разработке мер борьбы рекомендуется следующий подход.
Если в ранее благополучном по туберкулезу хозяйстве туберкулинизацией выделяются животные с нехарактерными реакциями на туберкулин, спешить с объявлением хозяйства неблагополучным по туберкулезу не следует. Необходимо провести контрольно-диагностический убой нескольких животных и материал от них исследовать на туберкулез в лабораторных условиях согласно действующей инструкции. Остальных животных, реагирующих на туберкулин, нужно изолировать от основного поголовья и через 30 - 45 дней подвергнуть повторной туберкулинизации симультанной аллергичёской пробой с туберкулином и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КAM) согласно наставлению.
B тех хозяйствах и стадах крупного рогатого скота, где симультанная проба с KAM не позволяет отдифференцировать неспецифические реакции, можно применять последовательно другие методы дифференциации неспецифических реакций на туберкулин:
-
При жизни животных, выделенных с аллергической реакцией на туберкулин:
-
реакция бласттрансформации лимфоцитов; через 12 дней после туберкулинизации;
-
реакция специфического лизиса лейкоцитов; через 12 дней после
-
туберкулинизации;
-
надплевральная новокаиновая блокада; за 6 дней до повторной
-
туберкулинизации;
-
внутривенное введение 10% раствора хлористого кальция;
-
повторная туберкулинизация через 30 - 45 дней с туберкулинами ППД и КАМ;
-
внутривенная туберкулиновая проба.
-
Контрольно-диагностический убой двух-трех животных:
-
макроскопические исследования;
-
бактериоскопия;
-
посевы на питательные среды;
-
биопроба на морских свинках;
-
гистологические исследования.
-
Заражение и последующий убой лабораторных животных:
-
макроскопические исследования;
-
бактериоскопия;
-
посевы на питательные среды;
-
биопроба на морских свинках, 2-й пассаж.
Реакция бласттрансфорцации лимфоцитов (РБТЛ) - это превращение малых лимфоцитов под влиянием неспецифических и специфических воздействий в бласты - молодые клетки с крупным ядром и базофильной цитоплазмой. Для постановки реакции чаще всего используют лимфоциты периферической крови. При воздействии туберкулином на лимфоциты животных, больных туберкулезом, бластообразование в среднем составляет 9,18 ± 0,94%. По мере прогрессирования туберкулезного процесса блаетообразование подавляется и составляет 0,4 ± 0,08%.
У здоровых животных и у животных, реагирующих не специфически на туберкулин, бластообразование лимфоцитов находится постоянно на одном уровне и в среднем составляет 0,89 ± 0,22% (M.В. Харитонов, 1981, 1982).
Кровь берут из яремной вены (не более 10 мл) в биологические пробирки размером 20x200 мм, в которые предварительно добавляют гепарин (для инъекций) из расчета от 4 до 25 единиц на 1мл крови. Содержимое перемешивают путем 2 - 3-кратного перевертывания пробирок и оставляют на 5 - 6 часов при комнатной температуре в горизонтальном положении, под углом 10°С. Через 5 - 6 ч пробирки ставят на 15 - 20 минут под углом 45°С. При этом, между эритроцитами и плазмой, накапливается значительное количество лимфоцитов в виде дымчатой пленки. Плазму крови вместе с лимфоцитами отсасывают и переносят во флаконы для постановки реакции бласттрансформации лимфоцитов. Подсчитывают количество лейкоцитов и плазму разводят средой 199 с антибиотиками так, чтобы в 1 мл плазмы было 1 млн. лейкоцитов.
Полученную взвесь разливают по 5 мл в 2 флакона, в один из них добавляют в качестве антигена ППД туберкулин из расчета 60 мкг/мл, а второй оставляют без антигена - он служит контролем. Флаконы закрывают тугими резиновыми пробками и выдерживают 5 суток в термостате при температуре 37°С. После этого флаконы встряхивают, содержимое переливают в центрифужные пробирки. После 10 минутного центрифугирования (1000 об/мин) верхний слой сливают, а из осадка делают тонкие мазки, которые фиксируют метанолом и красят по Романовскому - Гимзе. B окрашенных мазках проводят подсчет лимфоцитов и бластов. В каждом мазке подсчитывают не менее 200 клеток. Выводят соотношение бластов к лимфоцитам в процентах.
Реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ ) основана на разрушении лейкоцитов под влиянием аллергена - туберкулина. Для постановки реакции в пробирку, содержащую 0,1 единиц гепарина, вносят 5мл крови, взятой из яремной вены животного, и перемешивают. Затем из этой пробирки вносят по 0,9 мл крови в две другие пробирки. B одну из них добавляют 0,1 мл туберкулина (опытная), а в другую 0,1 мл физраствора (контрольная). Жидкость в пробирках перемешивают и инкубируют 2 ч при 37 °C при периодическом легком встряхивании. После этого, подсчитывают количество лейкоцитов в опытной и контрольной пробирках в камере Горяева по общепринятой методике и вычисляют показатель РСЛЛ в процентах по формуле: РСЛЛ = (Лк - Ло) / Лк 100, где Лк - количество лёйкоцитов в контрольной пробе, Ло - количество лейкоцитов в опытной пробе с аллергеном.
РСЛЛ считают положительной у крупного рогатого скота при показателе 10% и более (10...20...35.....±2,05). У здоровых животных показатель РСЛЛ не превышает в среднем 6,57±0,30. Надплевральная новокаиновая блокада по В.В. Мосину . B хозяйствах, условно благополучных по туберкулезу, животным, реагирующим на внутрикожное введение туберкулина, с целью дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций за 6 дней до повторной туберкулинизации делают надплевральную новокаиновую блокаду по В.В. Мосину.
Оценка туберкулиновых реакций при повторной туберкулинизации следующая: неспецифические реакции на туберкулин исчезают, а у животных, инфицированных возбудителем туберкулеза, она сохраняется (М.В. Харитонов, 1982).
Техника надплевральной новокаиновой блокады по В.В. Мосину сводится к введению впереди ножек диафрагмы в надплевральную клетчатку, окружающую пограничный симпатический ствол и чревные нервы, 0,5%ного раствора новокаина. У основания последнего ребра с обеих сторон подготавливают операционное поле. Стерилизуют шприц и две инъекционные иглы длинной 12 -14 см диаметром 2 мм. Определяют место, направление и глубину введения иглы. Делается это так: указательным пальцем правой руки прощупывают передний край последнего ребра и затем палец продвигают по нему до дорсальной группы позвоночных мышц. При надавливании в этом месте между подвздошно-реберной, и длиннейшей мьшщами спины прощупывают желобок, который у крупных животных находится латеральнее сагитальной плоскости на ширину ладони. Точка пересечения переднего края последнего ребра с латеральным краем длиннейшей мышцы спины является местом укола.
Предварительно кожу, подкожную клетчатку и мышцы в месте введения иглы инфильтрируют 0,5%-ным раствором новокаина. После этого под углом 30 - 35° к горизонтальной плоскости вводят иглу и продвигают ее параллельно переднему краю ребра до упора в тело предпоследнего грудного
