бактериологического исследования. Каждый из методов диагностики имеет ценность лишь в совокупности с другими методами, в особенности с результатами патологоморфологических и бактериологических исследований [115,139,141].
Обнаружение у заболевших животных сходной с пастереллезом клинической картины не дает права ставить диагноз на пастереллез, так как имеется ряд заболеваний, клиническое течение которых очень напоминает пастереллез. Патологоанатомические данные достаточно выражены при остром течении пастереллеза, но не патогномоничны, и ставить диагноз только на основании их нельзя. Выделение культуры пастерелл при бактериологическом исследовании без учета результатов, полученных другими диагностическими методами, также не дает оснований для постановки диагноза на это заболевание, так как при пастереллезе наблюдается широкое бактерионосительство как среди переболевших, так и среди клинически здоровых животных, контактировавших, а иногда и неконтактировавших с животными неблагополучных хозяйств. Совокупность сведений по эпизоотологии, клинической и патологоанатомической картине дает право на постановку предварительного диагноза, результаты же бактериологических и биологических и молекулярно-биологических исследований позволяют поставить диагноз окончательно [139,142]. Клинические признаки не имеют большого диагностического значения. Исключительно ценные данные для правильной постановки диагноза при остром и подостром течениях пастереллеза дают патологоанатомическое исследования. Прижизненная бактериологическая диагностика пастереллеза также не имеет большого значения, чаще исследуют материал от павших животных. Результаты лабораторного исследования этого материала дают возможность уточнить первоначальный диагноз [6,7,9,17,18,37].
Для бактериологического исследования в лабораторию посылают отдельные органы (сердце, селезенку, печень и др.). Патологический материал лучше посылать свежий или замороженный, либо в консервирующей жидкости – 30%-ный водный раствор глицерина.
Бактериологическая диагностика пастереллеза слагается из
следующих методов:
-
микроскопии мазков крови или мазков-отпечатков внутренних органов (печень, селезенка);
-
выделения культур P.multocida из патологического материала путем высева на искусственные питательные среды или биологическим методом, заражая лабораторных животных;
-
идентификации культуры;
-
определения вирулентности выделенных культур на лабораторных животных.
При острых инфекционных болезнях, к которым относится и пастереллез, серологический диагноз имеет меньшее значение, чем такие методы диагностики, как бактериологический и биологический, так как болезнь протекает быстро. Но с целью своевременного и более полного выявления и в неблагополучных и в благополучных хозяйствах скрытых больных и животных-пастереллоносителей применение серологических реакций имеет большое значение.
Для серологической диагностики используют реакции агглютинации, связывания комплемента, преципитации, гемагглютинации, адсорбции агглютининов и другие.
Реакцию агглютинации (РА) пробовали применять для выявления птиц-пастереллоносителей, но отсутствие стандартных антигенов не позволяло дать объективную оценку этому методу диагностики, хотя S.Nomioka и M.Murata довольно успешно с помощью реакции агглютинации разделили соматические антигены на несколько групп. По различию в О-антигенном строении изученные 166 штаммов (выделенных от крупного рогатого скота – 26; свиней – 43; овец – 7; мышей – 18; кошек – 1; птиц – 69; человека - 2) были распределены на 10 групп. Группируя по соматическому и капсульному антигенам, все штаммы удалось разделить на 12 серологических типов (групп). В капсульную группу А входило пять соматических групп (1, 3, 5, 7 и 9), в группу Д – пять О-групп (1, 2, 3, 4 и 10) и одна из О-групп (6) была в группе В (G.R.Carter), к 12-му серотипу отнесены все остальные штаммы. На основании полученных данных авторы предлагают характеризовать штаммы P.multocida по соматическому и капсульному антигенам и в связи с этим именовать их 1:А, 3:А, 2:В и т.д. Штаммы 1:А и 3:А имеют общий капсульный антиген А, но различные (1 и 3) соматические антигены. Почти все культуры от цыплят и уток, больных пастереллезом, принадлежали к серотипу 5:А, от индеек - К 9:А. Несколько штаммов типа 2:Д были изолированы от цыплят при хроническом течении пастереллеза [48,92,70].
Большинство авторов ставили РА по обычно принятой методике, но антигены готовили по-разному, поэтому результаты, полученные с испытуемыми сыворотками птиц, были неодинаковыми.
S.Nomioka и M.Murata для постановки РА на стекле была предложена упрощенная методика. Антиген получали по особой методике – культуру пастерелл выращивали на УРС-агаре, предложенном авторами, причем рост был обильным, затем смывали формализированным буферным раствором. Типовые (эталонные) антисыворотки готовили по капсульному антигену штаммов А, В, С, Д по G.R.Carter. S.Nomioka и M.Murata применяли РА также для типирования пастерелл не только по капсульному антигену, но и по соматическому [48].
Применяется и реакция диффузионной преципитации (РДП), где для изготовления антигена К.П.Чепуров обрабатывается взвесь пастерелл в физиологическом растворе двукратным объемом хлороформа. А.Н.Борисенкова получала антигены из выращенной на МПА с 10% аминопептидом 2-суточной культуры пастерелл, смытых физиологическим раствором и прогретых в водяной бане при 56-580 С в течение 30 мин. После 20-минутного центрифугирования при 5000 об/мин супернатант был использован в качестве антигена [143,144]. Гипериммунные сыворотки получают путем иммунизации кроликов эталонными штаммами. Для этих целей используется та же методика гипериммунизации кроликов, как и в РА. Сыворотки и антигены в реакции использовали неразведенными, в эквивалентных объемах. Чашки Петри с реагентами помещали во влажную камеру при комнатной температуре, реакцию учитывали при постановке РДП в макромодификации в чашках Петри через 24-72 часа, а в микромодификации (на стеклянных пластинках 9 х 12) - через 18-24 часа. В обоих случаях использован агар Дифко [145].
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) в настоящее время считается наиболее точной серологической реакцией для выяснения иммунобиологического состояния. G.R.Carter применял ее для изучения иммунитета у птиц, иммунизированных против пастереллеза. Чаще она используется для идентификации различных серотипов пастерелл, имеющих капсулу. Реакцию ставят и учитывают по общепринятой методике в пробирках или на плексиглазовой пластинке с углублениями [146]. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен в начале 70х годов тремя группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США. К концу ХХ века этот метод прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. На сегодняшний день ИФА-диагностика является наиболее часто используемым диагностическим методом. В настоящее время в России и Казахстане для исследований на пастереллез животных используется набор для выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida) иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция). Сущность ИФА пастереллеза, так же как и других болезней животных, заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при определенной
