длине волны. Результат выражают в единицах оптической плотности [147]. Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики. В то же время метод ИФА в различных его модификациях мало эффективен в случае необходимости дифференциации типовой и штаммовой принадлежности микроорганизмов. ИФА выявляет белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции [148].
В последнее время, к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний животных добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий.
К концу 90-х г. в микробиологической практике получило широкое развитие использование новых методических подходов, как в прикладном, так и фундаментальном аспекте. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы - рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике стало возможным в немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [149,150].
Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным анализ специфических ДНК-последовательностей многих патогенных микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и
относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких, как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов [151,152].
Основное преимущество этих методов, по сравнению с иммунологическими, состоит в возможности их использования при латентных и хронических инфекциях для широкого спектра патогенных микроорганизмов, а также определять генетическое родство возбудителей [153].
Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличаются друг от друга содержанием пуриновых и пиримидиновых оснований, которые формируют комплементарные пары в антипараллельных цепях ДНК. Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или схожее содержание ГЦ-пар в ДНК, а далеко отстоящие в генетическом отношении сильно отличаются по относительному содержанию этих азотистых оснований.
Более тонким методом оценки генетического сходства организмов является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов [154].
В настоящее время наиболее приемлемой филогенетической системой классификации прокариот является система, основанная на сопоставлении последовательности нуклеотидов в 16 S РНК. Эта система положена в основу «Руководства по систематической бактериологии Берджи» 2001 года. По Берджи пастереллы относятся к Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Pasteurellales, Pasteurellaceae, Pasteurella [90].
Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli принадлежат к γ подразделу протеобактерий, и включают очень много патогенных Гр- бактерий. Проведенный сравнительный анализ всего генома позволяет исследовать сравнительную эволюцию этих организмов в геномной лестнице. Установлено эволюционное родство между Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli [155].
В 1985 году появилась первая статья, описывающая революционизирующую технологию - полимеразную цепную реакцию - ПЦР. Множественные (амплифицированные в миллион раз) копии определенных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью ПЦР. В настоящее время, метод ПЦР или специфической амплификации ДНК широко используется как для диагностики, так и для дифференциации различных групп микроорганизмов. ПЦР поднимает лабораторную диагностику на иной уровень определения ДНК или РНК, что позволяет
прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. Внедрение метода в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в медицине и ветеринарии за последнее время. По данным журнала Labmedica International с 1995 г. наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста ее использования. В 1996 г. на ДНК-диагностику было потрачено 181.6 млн. долларов, а в 2002 г. затраты возросли до 1400 млн. долларов [156,157] .
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования – амплификации, специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой , как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизмов (specific PCR). Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей – множественная ПЦР (multiplex PCR) [158,159]. Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. В ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение в виду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом [160]. Альтернативный подход в ПЦР диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы: небольших (рода, семейства) или крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических организмов. Полученные в
