результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем идентифицированы молекулярными методами (секвенирование), чтобы сравнить амплифицированную ДНК с соответствующими последовательностями известных видов. [161,162,163,164,165]. На практике обычно используют менее трудоемкие и дорогостоящие методы, чем секвенирование которые, тем не менее, позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов [166,167,168]. ПЦР широко используется не только для идентификации, но также и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно, при проведении эпизоотологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. На практике выбор определенного метода типирования зависит от характера и целей проводимого эпизоотологического исследования, с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации и т.д. Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов [169,170,171]. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день
является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжевокрасной области видимого спектра (590 нм). Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦРлабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов [172,173].
Метод вертикального электрофореза. Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют . [174,175]
Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов (искусственно синтезированных участков ДНК) с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными приборами. В этом случае чаще всего используют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой в ИФА. Гибридизационные методы не получили пока широкого распространения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости методических манипуляций. Однако они интересны с точки зрения
массового скрининга, т.к. при наличии соответствующего оборудования могут быть легко автоматизированы [176,177,178,179].
Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15- 30 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или генов человека.
Дизайн праймеров (primer design) дословно с английского можно перевести как моделирование или конструирование праймеров. Сочетание из этих слов появилось вместе с тем, как была открыта полимеразная цепная реакция [180,181].
Дизайн праймеров – это не просто выбор праймеров. Сложность проводимой предварительной теоретической работы, связанной с дизайном праймеров, в значительной степени зависит от их дальнейшего назначения (применения). В ходе протекания полимеразной цепной реакции образуется продукт, называемый амплификатом. Амплификат содержит смесь ампликонов – основного, специфического, и побочных, неспецифических – отдельных продуктов реакции, отличающихся друг от друга длиной фрагмента (молекулярной массой). В идеале – это образование одного основного ампликона, который и является специфическим для выбранной пары праймеров [182,183,184,185,186,187].
Праймер, используемый в ПЦР, имеет специальное название – амплимер.
Конструирование праймеров проводится для решения одной из следующих задач:
1 Получение ПЦР-фрагмента, несущего видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для диагностики какого-либо заболевания (инфекционного или генетического); 2 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.) для клонирования в экспрессионный вектор или создания новых генетических конструкций;
3 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.) для последующего прямого секвенирования – определения первичной нуклеотидной последовательности – или для клонирования в вектор с целью последующего секвенирования;
